Оптогенетическое манипулирование нейронными цепями для перехода от сна к бодрствованию у мышей

Закрепите мышь под наркозом с открытым черепом в стереотаксической рамке.

Ядро ложа мозга терминальной полоски (BNST) содержит вирусно трансдуцированные нейроны, экспрессирующие светочувствительные катионные каналы.

Просверлите отверстия в черепе, вставьте оптические волокна и закрепите их опорными винтами и стоматологическим цементом.

Просверлите дополнительные отверстия для размещения сборки, содержащей электроды электроэнцефалографии (ЭЭГ) и электромиографии (ЭМГ), и закрепите ее клеем.

Обнажите мышцы шеи, чтобы вставить электродные провода ЭМГ, затем дайте восстановиться.

Подключите мышь к записывающей системе, поместите ее в экспериментальную камеру и дайте ей перейти в спящий режим.

Подавайте свет через оптическое волокно для активации светочувствительных катионных каналов, вызывая приток катионов, который генерирует потенциалы действия.

Сигналы распространяются в области, регулирующие сон, и способствуют бодрствованию.

Записывайте сигналы ЭЭГ для мониторинга активности мозга и сигналы ЭМГ для обнаружения мышечной активности для наблюдения за переходом от сна к бодрствованию.

Для имплантации электродов с помощью электроэнцефалограммы, или ЭЭГ, и электромиограммы, или ЭМГ, сначала припаяйте два провода из нержавеющей стали, от которых с обоих концов был снят один миллиметр изоляции, и поместите центр электродов на брегму. Затем отметьте положение для каждого электрода ЭЭГ.

Чтобы определить положение волоконно-оптического имплантата, прикрепите к манипулятору оптоволоконный наконечник и поверните манипулятор под углом плюс-минус 30 градусов относительно горизонтальной линии. Наденьте наконечник волокна на брегму и запишите координаты. Переместите наконечник к целевой линии введения и отметьте положение на черепе и положение анкерного винта рядом с местом введения.

Используйте бормашину, чтобы просверлить череп в каждом месте, и используйте манипулятор, чтобы аккуратно ввести оптическое волокно, пока оно не достигнет выше BNST. Наконечник должен упираться в оставшуюся черепную коробку. Закрепите волокно на черепе с помощью анкерного винта, стараясь не сломать твердую мозговую оболочку и не повредить ткани.

Затем покройте волокно и винт фотоотверждаемым стоматологическим цементом. Далее просверлите отверстия для электродов ЭЭГ/ЭМГ и вставьте наконечник первого электрода в одно отверстие. Удерживая имплантат одной рукой, нанесите цианоакрилатный клей на пространство между черепом и электродом и вставьте электрод до конца, стараясь не повредить ткани.

Когда все электроды будут размещены, покройте окружность электродов и оптических волокон дополнительным цианоакрилатным клеем и цианоакрилатным ускорителем, чтобы избежать прерывания в зонах соединения наконечника с оптическим кабелем и электрода с выводным проводом. Теперь обнажите мышцы шеи, и вставьте провода для электрода ЭМГ под мышцу. Отрегулируйте длину электрода ЭМГ так, чтобы он прилегал прямо под затылочными мышцами, и заполните имплантаты большим количеством цианоакрилатного клея и ускорителя.

Затем поместите мышь на грелку с контролем до полного возмещения. Для мониторинга ЭЭГ/ЭМГ во время фотовозбуждения целевых нейронов сначала используйте скаляр для регулировки интенсивности лазера и используйте наконечник для привязки кончика лазерного кабеля к неиспользуемому оптическому волокну. Убедитесь, что на стыке между волокном и кабелем нет места.

Через 20 минут излучайте разогретый лазер на средство проверки интенсивности и регулируйте интенсивность до 10 милливатт на миллиметр в квадрате. Установите длительность светового импульса на 10 миллисекунд, период отдыха на 40 миллисекунд, цикл на 20, а повтор на 20. Измените режим лазера на транзисторную логику и убедитесь, что световые импульсы излучаются из волокна, управляемого регулятором диаграммы.

Подсоедините имплантированный электрод и кабельный адаптер, затем закройте место соединения светонепроницаемым материалом для предотвращения утечки лазера. А когда лазер будет готов, переместите мышей в экспериментальную камеру для записи ЭЭГ/ЭМГ. Чтобы оценить задержку до пробуждения от небыстрого движения глаз или быстрого сна с быстрым движением глаз, ограничьте время записи и оптимизированное время получения места и позвольте мышам свободно перемещаться в экспериментальной камере в течение как минимум одного часа.

В течение экспериментального периода контролируйте сигналы ЭЭГ и ЭМГ на одном экране записи. Оценивайте состояние мыши как бодрствование, сон без быстрого движения глаз или сон с быстрым движением глаз, используя регулятор усиления для каждой волны, чтобы облегчить различение каждого состояния. Для измерения задержки сна от небыстрого движения глаз до бодрствования наблюдайте за стабильным сном без быстрого движения глаз в течение 40 секунд, затем включите генератор шаблонов для фотостимуляции и подтвердите лазерное излучение на имплантированные оптические волокна.

Затем записывайте сигналы ЭЭГ/ЭМГ до тех пор, пока состояние сна не изменится на бодрствование.