Культура первичных моторных и сенсорных нейронов в определенных СМИ по Electrospun поли-L-лактида нановолокон Строительные леса

Выровненные электроспиннинговые волокна BUN направляют рост нейронов in vitro и являются потенциальным компонентом скаффолдов для регенерации нервов. В данной работе создаются скаффолды из электроспиннинговых волокон BUN, на которых выращиваются первичные сенсорные и моторные нейроны крысы. Сначала волокнистые скаффолды наносятся методом электроспиннинга на стеклянные покровные стекла.

Затем первичные нейроны получают из эмбрионов крыс на 15-й день развития и культивируют на скаффолдах из электроспиннинговых волокон. Нейронам дают время прикрепиться и вырасти, после чего их фиксируют и окрашивают с помощью методов иммуноцитохимического анализа. Результаты визуализации выявляют изменения в морфологии нейронов, культивируемых на электроспиннинговых волокнах, что указывает на способность нанотопографии этих волокон направлять рост нейритов.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как использование трансформированных клеточных линий, заключается в том, что первичные нейроны in vitro более точно имитируют поведение нейронов in vivo, чем трансформированные клетки. Эти методы позволяют использовать электропроводящие волокна с другими типами клеток. Кроме того, культивируемые моторные и сенсорные нейроны могут быть использованы для других исследовательских целей.

Как правило, специалисты, которые впервые используют этот метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку электроспиннинг является капризным процессом, о чем мы более подробно рассказываем в сопровождающей видеостатье. Для подготовки подложек из электроспиннинговых волокон начните с приготовления 8% раствора поли(молочной-ко-гликолевой) кислоты (PLGA) в соотношении 85:15 в хлороформе и 4% раствора поли-L-лактида (PLLA) в хлороформе путем перемешивания при слабом нагреве. Затем нанесите PLGA на чистые стеклянные покровные стекла, покрывая поверхность каждого стекла раствором PLGA; дайте PLGA высохнуть до образования тонкой пленки, что занимает примерно 30 минут.

После высыхания PLGA с помощью токопроводящей углеродной ленты закрепите покровное стекло с покрытием PLGA либо на электроприводе колеса для получения ориентированных волокон, либо на неподвижной пластине для получения случайных волокон. Поместите шприц с 4% раствором PLLA в насос с наконечником, расположив его на расстоянии 20 сантиметров от коллектора.

Установите скорость подачи насоса примерно на 0,22 milliliters per hour. Установите скорость вращения двигателя колеса в диапазоне от 300 до 400 rotations per minute. Подайте отрицательное смещение постоянного тока -2 kilovolt на коллектор и +15 kilovolt на проводящую пластину, которая контактирует с металлическим наконечником.

При отсутствии доступа к заземлению двухполярного источника питания, волокна, вылетающие из наконечника шприца при запуске шприцевого насоса, будут собираться на вращающемся колесе. Продолжайте вращение до достижения желаемой плотности волокон. Чтобы предотвратить засорение металлического наконечника, периодически протирайте его бумажным полотенцем, закрепленным на непроводящем стержне. После завершения вращения нанесите линию PLGA по периметру покровного стекла с помощью пипетки, фактически создав «ров» вокруг электродов.

Дайте образцам высохнуть. Это позволит сохранить ориентацию волокон PLGA в процессе культивирования. Электроспиннинговые волокна и стеклянные контрольные образцы перед посевом клеток необходимо покрыть белком.

Для этого покройте подложки полиолом, лизином, ламинином или фибронектином минимум на один час. Затем аспирируйте избыток раствора до полного высыхания подложек. При использовании полиол-лизина подложку следует промыть в стерильной воде и дважды высушить после первоначального нанесения покрытия.

После высыхания поместите подложки в шестилуночные планшеты для культивирования тканей, чтобы подготовить культуру клеток, которые будут выращиваться на электропряденых волокнах. Получите эмбрионы E 15 от эвтаназированной беременной крысы. Начните со стерилизации области 70% ethanol, после чего аккуратно раздвиньте кожу живота.

Разрежьте слои кожи и мышц, чтобы открыть брюшную полость. Найдите матку и отделите её в области шейки матки и яичников. Перенесите матку в стерильную чашку.

Затем извлеките эмбрионы из матки с помощью ножниц и немедленно перенесите их в теплый раствор L 15. После декапитации эмбрионов поместите один эмбрион на бок, зафиксировав его одним зажимом так, чтобы не повредить спинной мозг. С помощью другого зажима удалите конечности и органы брюшной полости.

Затем поверните эмбрион и зафиксируйте его одним пинцетом. Срезайте ткани вдоль всего эмбриона от шеи к хвосту, пока спинной мозг не будет полностью обнажен. Осторожно захватите конец спинного мозга, затем вытяните его, перекладывая через самого себя в сторону хвоста.

При извлечении спинной мозг отделяется вместе с прикрепленными мембранами и ганглиями задних корешков. Если планируется проведение эксплантации ганглиев задних корешков или создание культуры диссоциированных сенсорных нейронов, отсеките ганглии задних корешков от спинного мозга и перенесите их в чашку с подогретой средой L 15. Для создания культуры моторных нейронов.

Захватите мембрану спинного мозга на переднем конце спинного мозга и отделите ее, сдвигая вниз. Подобно тому, как снимают длинный носок, повторите эту процедуру для всех эмбрионов, после чего с помощью пинцета измельчите спинной мозг на маленькие фрагменты для получения культур двигательных нейронов.

Перелейте измельченные спинные мозги и среду L 15 в коническую пробирку и центрифугируйте при 180 ×g в течение двух-трех минут. Для осаждения фрагментов удалите супернатант и добавьте 3 mL трипсина к осажденным тканям спинного мозга. Поместите пробирку в водяную баню при 37 °C и инкубируйте в течение 20 минут.

После инкубации добавьте в коническую пробирку три миллилитра FBS. Затем центрифугируйте при 180 ×g в течение двух-трех минут для осаждения. Тем временем подготовьте пастеurizedную пипетку с помощью FBS, втянув FBS в пипетку, а затем вытеснить её.

Это предотвращает прилипание фрагментов ткани к стеклу во время тритурации. После центрифугирования удалите супернатант. Затем добавьте в коническую пробирку одну пастеровскую пипетку среды L 15 и аккуратно тритурируйте, используя пипетку, покрытую FBS, до тех пор, пока раствор не станет гомогенным и в нем не исчезнут видимые комки.

Избегайте образования пузырьков. Подготовьте одну пробирку с тремя миллилитрами 9%opre в L 15 на каждые два эмбриона. Если количество эмбрионов нечетное, добавьте одну каплю.

Гомогенизированный раствор находится над раствором OptiPrep; равномерно распределите гомогенат по всем пробиркам. Гомогенат образует видимый мутный слой поверх раствора OptiPrep. Центрифугируйте пробирки при 700 ×g в течение 15 минут.

Осторожно соберите по два миллилитра верхнего слоя из каждой пробирки и перенесите их в коническую пробирку объемом 50 мл. Долейте в пробирку среду L 15 и центрифугируйте при 180 ×g в течение пяти минут, чтобы промыть клетки от опиратов. Удалите супернатант.

Осадок редко виден невооруженным глазом. На этом этапе, Риз, суспендируйте клетки в небольшом объеме среды для посева. Подсчитайте количество клеток, используя метод исключения трипан-синего, чтобы определить живые клетки.

Теперь клетки готовы к посеву. Для получения культур сенсорных нейронов ожидаемая чистота должна составлять более 90% нейронов. Начните с перелива спинномозговых узлов, извлеченных из спинного мозга, и среды L 15 в коническую пробирку.

Центрифугируйте при 180 ×g в течение двух-трех минут для осаждения фрагментов. Слейте супернатант и добавьте три миллилитра трипсина к осадку DRG, затем инкубируйте на водяной бане при 37 °C. Через 10 минут извлеките пробирку из водяной бани, добавьте в нее три миллилитра FBS и центрифугируйте при 180 ×g в течение двух-трех минут для повторного осаждения.

Тем временем обработайте пастеровскую пипетку огневым полированием и смажьте ее FBS. Как и прежде, используя пипетку, покрытую FBS, добавьте в осадок один полный объем среды L 15 и осторожно тритуйте до достижения гомогенности раствора без видимых комочков. Избегайте образования пузырьков воздуха после центрифугирования гомогената при 180 $\times\text{g}$ в течение пяти минут.

Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в небольшом объеме среды для посева сенсорных нейронов. Подсчитайте количество клеток, используя метод исключения трипанового синего, чтобы определить количество живых клеток. Теперь клетки готовы к посеву для культивирования сенсорных или моторных нейронов.

Начните с того, что нанесите несколько капель среды на подложки из волокон электропрядения, покрытых белком. Затем добавьте соответствующий объем клеточной суспензии. Диссоциированные клетки следует высевать с низкой плотностью.

Дайте клеткам прикрепиться в течение как минимум одного часа в инкубаторе, прежде чем заполнить лунки средой и вернуть их в инкубатор для культивирования. Покройте субстраты из электроспиннинговых волокон с белковым покрытием несколькими каплями среды для спинномозговых ганглиев задних корешков. Затем добавьте в среду ганглии задних корешков спинного мозга.

Расположите спинальные ганглии так, чтобы они были равномерно распределены по подложке. На покровном стекле размером 22 by 22 миллиметра поместится примерно четыре спинальных ганглия. Поместите культуры спинальных ганглиев в инкубатор при 37 °C и оставьте их минимум на четыре часа для адгезии после инкубации.

Заполните лунки средой и верните их в инкубатор. Культуры могут поддерживаться до четырех дней без замены среды. При более длительном культивировании следует проводить частичную замену среды (наполовину) с использованием питательной среды.

Питательная среда имеет тот же состав, что и среда для посева, но без L-glutamine. После достижения клетками нужного временного интервала можно провести иммуноцитохимический анализ в соответствии с инструкциями, изложенными в прилагаемом письменном протоколе. На этом СЭМ-изображении показана типичная морфология ориентированных и случайных электроспининговых волокон.

Ориентация волокон регулируется выбором коллектора. Обратите внимание, что волокна, полученные на вращающемся колесном коллекторе, имеют равномерную ориентацию. Напротив, волокна, полученные на стационарном коллекторе, имеют случайную морфологию.

На этих изображениях показано окрашивание мотонейронов на бета-тубулин (зеленым цветом) и окрашивание ядер красителем DPI (синим цветом). После 24 часов культивирования на волокнах, покрытых PLL, и на стекле с волокнами мотонейроны обычно имеют несколько отростков, которые отходят от тела клетки параллельно направлению выравнивания волокон, которое на данном изображении направлено слева направо. Основные отростки клеток, культивируемых на волокнах, значительно длиннее основных отростков клеток, культивируемых на стекле при аналогичном времени инкубации.

Мотонейроны, выращенные на стекле, обычно имеют больше отростков через 24 часа, которые радиально расходятся от тела клетки. Нейроны, выращенные на волокнах. Главный отросток на стекле также короче, чем те, что видны на волокнах на данных изображениях.

Ганглии задних корешков окрашены на нейрофиламенты, показанные зеленым цветом. После трех дней культивирования на стекле, покрытом PLL, и на стеклянных волокнах нейриты радиально отходят от ганглия заднего корешка. Также наблюдается значительное перекрытие соседних нейритов на волокнах.

Нейриты также радиально расходятся от ганглия. Однако впоследствии они поворачивают и следуют в направлении выровненных волокон. После освоения данных процедур перекрытие соседних нейритов значительно уменьшается.

Электропрядение занимает примерно 30 минут; получение моторных и сенсорных нейронов осуществляется примерно за два часа. При выполнении данной процедуры важно соблюдать правила стерильности. Для этапа переноса необходимо использовать пипетку с огнеполированным концом, чтобы максимально повысить выживаемость нейронов.

Кроме того, важно инкубировать молекулу адгезии и электроспиннинговые волокна в течение подходящего времени. Например, если волокна покрывают полилизином менее одного часа, покрытия будет недостаточно для обеспечения адгезии клеток. Однако при слишком длительном воздействии полилизина, например в течение ночи, волокна могут подвергнуться деградации.

Также важно помнить, что большинство микроскопов не позволяют визуализировать нейроны на волокнах в процессе культивирования. Это связано с тем, что волокна и нейрональные отростки выглядят очень похоже. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выращивать первичные культуры двигательных и сенсорных нейронов крыс 15-го эмбрионального дня на подложках из электроспиннинговых волокон.

Не забывайте, что работа с высоким напряжением может быть чрезвычайно опасной; необходимо всегда принимать соответствующие меры предосторожности, чтобы изолировать оператора от установки для электропрядения.