Стереотаксическая трансплантация суспензии нервных клеток мышам с черепно-мозговой травмой

Начните с предварительно нагруженного шприца, прикрепленного к стереотаксическому шприцевому насосу.

Шприц содержит индуцированную человеком суспензию плюрипотентных стволовых клеток, полученную из нервных клеток.

Расположите иглу над хирургически обнаженной корой головного мозга мыши с черепно-мозговой травмой.

Опустите шприц, чтобы коснуться кончиком иглы твердой мозговой оболочки, отрегулируйте координаты так, чтобы нацелиться на место травмы, и слегка втяните. Теперь

сделайте небольшой разрез, установив точку входа для иглы.

Далее опустите поршень, чтобы дать возможность протекать клеточной суспензии.

Опустите иглу и проникните в мозг, чтобы достичь границы серого вещества и белого вещества глубокой коры.

Наконец, медленно вводите клеточную суспензию, одновременно орошая место операции физиологическим раствором для поддержания гидратации.

По завершении извлеките иглу, повторно проведите орошение и закройте разрез.

Со временем трансплантированные клетки созревают, восстанавливают нейронные цепи и восстанавливают повреждения мозга.

Примерно через 24 часа после краниэктомии поместите мышь обратно в стереотаксическую рамку.

Накройте мышь фенестрированной хирургической простыней. Промывайте место разреза стерильным физиологическим раствором, чтобы очистить место и ослабить швы. Используйте ватный тампон, пропитанный 70% этанолом, чтобы аккуратно простерилизовать место разреза, и используйте тонкий пинцет и офтальмологические ножницы для снятия швов.

Затем орошайте место операции и краниэктомии обильным стерильным физиологическим раствором. В колпаке биобезопасности для клеточных культур осторожно покрутите или постучите по трубке клеток, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. С помощью микропипетки загрузите примерно 7,5 микролитров клеток в шприц Hamilton через конец поршня.

Держа шприц под углом 120 градусов концом плунжера вниз, вставьте поршень, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха между суспензией и наконечником поршня. Прикрепите узел прокладки к игле пипетки и прикрепите иглу к шприцу. Нажмите на поршень, чтобы переместить клеточную суспензию в иглу пипетки и присоедините шприц к стереотаксическому шприцевому насосу.

Продвинуте поршень, чтобы убедиться, что узел шприцевого насоса работает правильно, и переместите иглу в координаты для инъекции. Выровняйте кончик иглы по брегме и установите координаты x и y на ноль. Переместите кончик иглы над местом краниэктомии на два миллиметра в сторону и минус один миллиметр позади брегмы и коснитесь кончиком иглы поверхности твердой мозговой оболочки.

Слегка приподнимите иглу, затем сделайте небольшой надрез в твердой мозговой оболочке в том месте, где игла соприкоснулась. Установите стереотаксическую координату в равное нулю z и нажмите на поршень, чтобы убедиться, что клеточная суспензия течет адекватно, прежде чем вводить иглу в мозг. Введите иглу в мозг на глубину z, равную минус 1,4 миллиметрам, чтобы поместить трансплантат на границе серого вещества/белого вещества глубокой коры.

Запустите шприцевой насос, чтобы ввести клеточную суспензию в течение 15 минут. Используйте микроскоп с большим рабочим расстоянием для контроля оттока клеточной суспензии, орошая место операции стерильным физиологическим раствором во время инъекции для поддержания гидратации тканей. Когда все клетки будут доставлены, медленно извлеките трансплантационную иглу и орошите место операции дополнительным физиологическим раствором, прежде чем закрыть разрез новыми швами.

Затем обеспечьте послеоперационный уход, как показано на рисунке.