Лентивирусная трансдукция нейральных клеток-предшественников для эпигенетической регуляции экспрессии альфа-синуклеина

Разморозьте нейронные клетки-предшественники или NPC, хранящиеся с криопротектором в тепловом блоке.

Эти NPC экспрессируют повышенное содержание альфа-синуклеина, что является ключевым фактором болезни Паркинсона.

Перенесите размороженные клетки в пробирку, содержащую теплые базальные среды, чтобы разбавить криопротектор.

Центрифуга для гранулирования клеток, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования гранулы в нейронных средах.

Добавьте клеточную суспензию на многолуночный планшет с покрытием ECM и инкубируйте, чтобы обеспечить адгезию и пролиферацию клеток.

Добавьте лентивирусные векторы, содержащие направляющую РНК, деактивированную Cas9-ДНК-метилтрансферазу и ген устойчивости к антибиотикам.

Инкубация для облегчения проникновения вируса, обратной транскрипции вирусной РНК, интеграции в геном хозяина и экспрессии трансгенов.

Направляющая РНК направляет dCas9 к гену альфа-синуклеина, где метилтрансфераза-опосредованное метилирование ДНК снижает экспрессию альфа-синуклеина.

Замените среду на нейросреды, содержащие антибиотики, чтобы выбрать трансдуцированные клетки, в то время как нетрансдуцированные клетки подвергаются апоптозу.

Поместите криовиал с MD NPC в термоблок с температурой 37 градусов Цельсия на две минуты и перенесите размороженные клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров с 10 миллилитрами теплого DMEM-F12.

Центрифугируйте при 300 г в течение пяти минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в двух миллилитрах предварительно подогретой полной среды N2B2. Добавьте два миллилитра N2B27 в клеточную суспензию и нанесите по два миллилитра клеток в каждую лунку предварительно подготовленного шестилуночного планшета, покрытого BMM.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO_2 в течение ночи. Когда МД-NPC находятся на 70% конфлюенции, трансдуцируйте их, добавив два микролитра векторов лентивирусной направляющей РНК d-Cas9-DNMT3A и осторожно взболтайте пластину. После инкубации клеток в тех же условиях, что и ранее, в течение 16 часов замените среду N2B27 через 48 часов после трансдукции.

Добавьте N2B27 с пятью микрограммами на миллилитр пуромицина