Лентивирусная трансдукция нейральных клеток-предшественников для эпигенетической регуляции экспрессии альфа-синуклеина

Разморозьте нейронные клетки-предшественники или NPC, хранящиеся с криопротектором в тепловом блоке.

Эти NPC экспрессируют повышенное содержание альфа-синуклеина, что является ключевым фактором болезни Паркинсона.

Перенесите размороженные клетки в пробирку, содержащую теплые базальные среды, чтобы разбавить криопротектор.

Центрифуга для гранулирования клеток, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования гранулы в нейронных средах.

Добавьте клеточную суспензию на многолуночный планшет с покрытием ECM и инкубируйте, чтобы обеспечить адгезию и пролиферацию клеток.

Добавьте лентивирусные векторы, содержащие направляющую РНК, деактивированную Cas9-ДНК-метилтрансферазу и ген устойчивости к антибиотикам.

Инкубация для облегчения проникновения вируса, обратной транскрипции вирусной РНК, интеграции в геном хозяина и экспрессии трансгенов.

Направляющая РНК направляет dCas9 к гену альфа-синуклеина, где метилтрансфераза-опосредованное метилирование ДНК снижает экспрессию альфа-синуклеина.

Замените среду на нейросреды, содержащие антибиотики, чтобы выбрать трансдуцированные клетки, в то время как нетрансдуцированные клетки подвергаются апоптозу.

Поместите криовиал с MD NPC в термоблок с температур