Внутриутробная вирусная трансдукция у мышей

Возьмите смесь вируса, содержащую нужный ген для трансдукции, и краситель для слежения в буфере.

Аспирируйте смесь вирусов и красителей в капилляр с тонким концом.

Возьмите беременную мышь под наркозом с выбритой брюшной областью.

Продезинфицируйте кожу этанолом с последующим нанесением раствора бетадина.

Сделайте разрез по средней линии, чтобы обнажить брюшную полость, и наложите на него парафиновую пленку.

Обнажите рога матки и налейте на них буфер, чтобы предотвратить сухость.

Обратите внимание на порядок и положение эмбрионов. Отрегулируйте положение эмбриона в маточном мешке, чтобы получить доступ к местам инъекций.

Введите смесь вируса и красителя в спинной мозг и желудочки головного мозга.

Обеспечьте точную инъекцию, визуализируя распределение красителя.

Поместите рога матки обратно в брюшную полость и налейте немного буфера.

Зашиваем брюшную полость, а затем кожу.

Введенный вирус проникает в клетку-хозяина, высвобождая ген-мишень и обеспечивая его экспрессию.

Начните с загрузки специализированного капиллярного наконечника, содержащего от четырех до 11 вирусных частиц покрытия аденоассоциированного вируса типа 1 для желаемой мишени и помеченного красителем Fast Green, на аспираторную пробирку. Добавьте в капилляр 15 микролитров меченых аденоассоциированных вирусных частиц.

Затем подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги у обезболенной эмбриональной мыши на 14,5-й день беременности и продезинфицируйте кожу. Используйте изогнутые зубчатые щипцы для радужной оболочки глаза и прямые ножницы из карбида вольфрама, чтобы сделать разрез кожи по средней линии. Используя прямой пинцет Дюмона, чтобы захватить стенку брюшины, продолжайте движение вдоль белой линии прямыми ножницами Ваннаса и поместите кусок фенестрированной парафиновой пленки над брюшным отверстием и используйте устройство, похожее на ложку, чтобы обнажить рога матки, не повреждая эмбрионы внутри рогов.

После нанесения нескольких капель PBS с температурой 37 градусов Цельсия на рога матки осмотрите эмбрионы на предмет повреждений или пороков развития внутри маточного мешка. Осторожно переворачивайте эмбрионы внутри мешочков до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое положение для каждой инъекции. Когда эмбрионы будут на месте, введите от одного до двух микролитров раствора вирусных частиц, меченных Fast Green, в каждый эмбрион.

После того, как все эмбрионы будут введены, поместите рога матки обратно в брюшную полость и добавьте несколько капель PBS с температурой 37 градусов Цельсия в брюшную полость. Затем используйте полиамидные шовные материалы размера 6-0 для закрытия брюшинной стенки и полиамидные шовные материалы размера 3-0 и гемостатические щипцы Холстеда Mosquito для закрытия кожи.