Инъекция флуоресцентных нейронных клеток-предшественников в органоиды головного мозга человека для моделирования трансплантации
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:40 мин • August 29th, 2025
Начните с флуоресцентно меченых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из нейральных клеток-предшественников или NPC.
Ресуспендируйте клетки в гидрогеле с внеклеточным матриксом для создания однородной клеточно-матричной смеси.
Инкубируйте смесь на льду.
Затем перенесите органоид человеческого мозга в чашку.
Удалите излишки среды и поместите чашку под микроскоп для проведения процедуры инъекций.
Нанесите клеточную матричную смесь на предварительно охлажденное стерильное предметное стекло и аспирируйте ее с помощью предварительно охлажденного шприца.
Медленно вводите смесь на поверхность органоида, чтобы свести к минимуму разрушение тканей.
Дайте органоиду немного отдохнуть, затем добавьте среду, переложите органоид в многолуночный планшет и инкубируйте.
Гидрогель затвердевает, закрепляя NPC в месте инъекции. Отслеживайте NPC с помощью флуоресцентной микроскопии.
Со временем NPC размножаются и мигрируют в отдаленные области органоида, где они дифференцируются на незрелые и зрелые нейроны.
Это обеспечивает надежную трансплантацию клеток с минимальным разрушением органоидов, подходящую для терапии нервными клетками.
Начните с удаления одиночной клеточной суспензии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или нейронных клеток-предшественников, полученных из ИПСК, или NPC, со льда и центрифугирования их при 300 г в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия.
Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в дозе 3 миллиграмма на миллилитр солюбилизированной матрицы базальной мембраны, чтобы получить окончательный объем в два микролитра на одну инъекцию. Немедленно поместите суспензию обратно на лед до момента использования. Переложите предварительно охлажденный шприц из морозильной камеры при температуре 20 градусов Цельсия в ведро со льдом для дальнейшего использования.
Далее извлеките органоидную пластину мозга из инкубатора и переложите органоид в 35-миллиметровую чашку с помощью наконечника с широким отверстием. Чтобы стабилизировать органоиды и облегчить инъекцию, удалите среду как можно больше, не повреждая органоид. Поместите 35-миллиметровую чашку, содержащую органоид, под препарирующий микроскоп, чтобы облегчить инъекцию.
Как только органоиды будут готовы к введению, осторожно ресуспендируйте меченые EGFP NPC-клетки с помощью охлажденного наконечника пипетки P20 и переместите два микролитра этих клеток на предварительно охлажденное стерильное предметное стекло. Возьмите со льда предварительно наполненный инсулиновый шприц и медленно наберите 2 микролитра клеточной суспензии скосом иглы вниз. Откройте крышку чашки, содержащей органоид, прежде чем навести на него микроскоп.
Придерживайте блюдо одной рукой, положите скос иглы вверх. А другой рукой медленно вводите клетку в поверхность органоида. После введения клеток поместите крышку обратно в чашку и инкубируйте введенный органоид в течение одной-двух минут.
Затем аккуратно добавьте 500 микролитров органоидной среды в планшет перед тем, как перенести органоид в 24-луночный планшет с широким отверстием. Инкубируйте органоид при температуре 37 градусов Цельсия и 5 процентах углекислого газа с полной сменой среды каждые два дня.
Обзор
В данной статье подробно описывается метод инъекции флуоресцентно меченных нейральных стволовых клеток (NPC), полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в церебральные органоиды человека. Эта методика сводит к минимуму повреждение тканей и обеспечивает эффективную трансплантацию клеток, что имеет решающее значение для терапии нейральных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Биология стволовых клеток
- Клеточная терапия
Теоретические основы
- Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Нейральные клетки-предшественники (НКП) имеют важное значение для развития и восстановления головного мозга.
- Церебральные органоиды человека служат моделями для изучения развития мозга.
- Для терапевтического применения необходимы эффективные методы трансплантации клеток.
Цель исследования
- Разработка надежного метода введения NPC в церебральные органоиды.
- Отслеживание поведения NPC после инъекции с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Оценка жизнеспособности и интеграции NPC внутри органоида.
Используемые методы
- Получение НПК из иПСК и их ресуспендирование в гидрогеле.
- Введение смеси клеток и матрикса в органоид с помощью предварительно охлажденного шприца.
- Мониторинг пролиферации и миграции НПК внутри органоида.
- Инкубация органоида в контролируемых условиях после инъекции.
Основные результаты
- NPCs были успешно интегрированы в органоид с минимальным нарушением его структуры.
- Флуоресцентная микроскопия подтвердила пролиферацию и миграцию NPCs.
- Инъецированные NPCs со временем дифференцировались в незрелые и зрелые нейроны.
- Метод продемонстрировал потенциал для применения в терапии нервных клеток.
Выводы
- Разработанная методика инъекции эффективна для трансплантации NPC.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области развития и восстановления мозга.
- В будущих исследованиях может быть изучена возможность терапевтического применения при нейродегенеративных заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Моделирование трансплантации нейральных клеток-предшественников в церебральные органоиды человека представляет собой воспроизводимую платформу без использования животных для оценки интеграции и дифференцировки клеток в контексте заболеваний ЦНС. Данный подход позволяет проводить прогностическую оценку стратегий терапии нейральными клетками на этапе доклинических исследований, обеспечивая механическое снижение рисков и трансляционную преемственность портфелей средств нейрорегенерации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать поведение нейральных клеток-предшественников в релевантной для человека 3D-модели мозга.
- Обеспечивает механистическую оценку рисков путем отслеживания пролиферации, миграции и дифференцировки клеток после трансплантации.
- Способствует функциональной валидации мишеней для кандидатов на клеточную терапию ЦНС.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает стандартизированный, воспроизводимый рабочий процесс для инъекции и отслеживания нейральных клеток в органоидах.
- Обеспечивает количественные данные с помощью флуоресцентной микроскопии для анализа судьбы и интеграции клеток.
- Подготавливает валидированные системы органоидов для последующего скрининга соединений или генетического анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует актуальным моделям заболеваний ЦНС с использованием органоидов человеческого происхождения.
- Обеспечивает непрерывный переход от этапа открытия к доклинической валидации подходов клеточной терапии.
- Поддерживает принятие решений по дальнейшему развитию с учетом рисков путем моделирования интеграции нейронов человека ex vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в континуум от поиска до доклинических исследований клеточной терапии ЦНС, связывая ранние механистические исследования с трансляционным моделированием.
- Открывательная биология: Обеспечивает проверку гипотез о приживлении и дифференцировке нейральных клеток в контексте человеческого организма.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные данные о судьбе и миграции клеток.
- Аналитика: Обеспечивает возможность статистического сравнения результатов трансплантации при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Предоставляет платформу для оценки поведения терапевтических клеток в органоидах, имитирующих патологические состояния.
- Промышленное применение: Предлагает масштабируемую систему без использования животных, адаптируемую к различным программам клеточной терапии ЦНС.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность механизмов и интеграции при клеточной терапии нейронов.
- Практическая ценность: Стандартизирует моделирование трансплантации с минимальным повреждением тканей и высокой воспроизводимостью.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности («go/no-go») для кандидатов на клеточную терапию ЦНС за счет раннего получения данных, релевантных для человека.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию активов клеточной терапии расстройств ЦНС с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, органоидами и методами микроинъекций.
- Необходим доступ к флуоресцентной микроскопии и инфраструктуре с контролируемым инкубационным режимом.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости протоколов подготовки клеток и инъекций.
- Метод применим к различным источникам нейральных клеток-предшественников и моделям органоидов.
- Ограничено моделированием ex vivo; трансляция in vivo требует дальнейшей валидации.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах
Похожие видео
0 Просмотры
Объединение человеческих органоидов и технологии «орган на чипе» для моделирования функциональности, специфичной для области кишечника
Похожие видео
0 Просмотры
Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов
Похожие видео
0 Просмотры
Трансплантация нейронных предшественников, полученных из стволовых клеток, в срезы коры головного мозга человека
Похожие видео
0 Просмотры
Трансплантация нейронных клеток-предшественников человека в мозг мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Метод in vitro для получения органоидов человеческого мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Человеческие нейронные органоиды для изучения рака мозга и нейродегенеративных заболеваний
Похожие видео
0 Просмотры
Внутримозговая трансплантация и отслеживание биолюминесценции in vivo нервных клеток-предшественников человека в мозге мыши
Похожие видео
0 Просмотры
Надежная и высоковоспроизводимая генерация органоидов кортикального мозга для моделирования старения нейронов головного мозга in vitro
Похожие видео
0 Просмотры
Церебральная органоидная модель трансплантации нервных клеток человека
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026