Обнаружение бактерий in situ в срезах дессенной ткани мышей

Возьмите десневой срез мыши, заражённый патогенными бактериями, предварительно обработанный для доступа к бактериальной ДНК.

Примените буфер с зондом ДНК, маркированным дигоксигенином, направленным на бактериальную ДНК.

Поставьте защитное покрытие и герметизацию, чтобы предотвратить обезвоживание образца.

Введите тепло для денатурации ДНК, затем инкубируем в жарких и влажных условиях для гибридизации зонда.

Охладите затвор, снимите защитный слой и несколько раз промывайте буфером, чтобы удалить незавязанные зонды.

Добавьте блокирующий раствор, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител.

Инкубировать с антителами, конъюгированными с ферментами, которые связываются с дигоксигенином.

Промывайте, чтобы удалить незавязанные антитела.

Добавьте ингибитор для селективной инактивации эндогенного фермента.

Нанесите субстрат, который реагирует с ферментом, чтобы получить цветной осадок.

Прополосните водой, чтобы удалить лишний субстрат.

Добавьте краситель для окрашивания ядер.

Стирайте, чтобы удалить лишний краситель.

Обезвоживайте в этаноле и обрабатывайте ксилолом для увеличения прозрачности тканей.

Поднимайся на секцию.

Под микроскопом визуализируйте бактерии внутри среза.

Начните на месте, сначала погружая слайды в 2x SSC на 20 минут. Тем временем разведите помеченный зонд до 1 нанограмма на микролитр в буфере гибридизации. Для отрицательного контроля используйте концентрацию в 10 раз выше немаркированного зонда. Затем денатурируйте зонды, нагревая их при 90 градусах Цельсия в течение 10 минут, затем быстро охлаждайте на льду.

Далее примените к каждому стеклу тот же объём разбавления зонда, что и протеиназу K. Затем аккуратно закройте скользящие и герметичные участки лаком для ногтей. Теперь нагрейте слайды на блоке ПЦР-аппарата при 90 градусах Цельсия в течение 10 минут и перенесите их на ночь в увлажнённый инкубатор с температурой 45 градусов Цельсия.

На следующий день охладите горки при 4 градусах Цельсия в течение получаса, а затем аккуратно снимите заслоны. Ткани хрупкие. Наконец, пропустите стекли через серию буфера SSC при комнатной температуре.

Стирайте гибридные стекли на месте в течение 5 минут в MABT. Затем нанесите 50–400 микролитров блокирующего раствора в 1% Tween 20 в течение 20 минут. После блочной инкубации нанесите 50–400 микролитров антитела анти-щелочной фосфатазы против DIG в блокирующем растворе.

Дайте ей завязать 90 минут при 37 градусах Цельсия. После нанесения первичного препарата промой стекли в MABT в течение 10 минут. Затем, на 5 минут, помещайте слайды в буфер обнаружения с 1% Tween 20.

Теперь нанесите 50–400 микролитров 1 миллимолярного левамизола в буферный раствор для обнаружения на каждое стекло и инкубируете их в течение 5 минут, чтобы инактивировать эндогенную щелочную фосфатазу. Далее добавьте от 50 до 400 микролитров NBT/BCIP, разбавленных в буфере обнаружения по 1–100 на каждый стекло, и дайте затворам инкубировать 2–3 часа в увлажнённой камере, исходя из опыта.

Прополосните стекли водой DI. Затем нанесите метилово-зелёный цвет с весом 0,05% по объёму и дайте противоокраске подействовать на ткани 10 минут при 37 градусах Цельсия. Снова промыйте стекли водой DI, затем обезвожите их 100% этанолом, после чего окуньте в ксилол. Наконец, нанесите 80 микролитров монтажного материала и накройте затвор стекла.