Протокол Рекомбинантный РосБР основе вакцины атипичной пневмонии: белковый препарат, вакцинация животных и нейтрализации Обнаружение

В данной процедуре подготавливают рекомбинантную вакцину, экспрессирующую белок RBD SARS COV, и оценивают ее способность индуцировать нейтрализующую активность против псевдовируса SARS. Сначала белок RBD экспрессируют и очищают из супернатанта культуры трансфицированных клеток 2 9 3 T. Затем очищенный белок используют для иммунизации.

Мышей и сыворотки собирают у вакцинированных животных в различные временные точки после иммунизации для количественной оценки нейтрализующего потенциала иммунных сывороток. Проводится анализ нейтрализации псевдовирусом: вырабатывается рекомбинантный псевдовирус SARS, экспрессирующий люциферазу, который затем инкубируют с титрованной сывороткой мыши. Затем оценивают способность этих нейтрализованных вирусов заражать клетки, экспрессирующие ко-рецептор ACE SARS, путем измерения относительной активности люциферазы в зараженных клетках.

Затем можно рассчитать титр 50% нейтрализующих антител. Меня зовут tu. В настоящее время я работаю в лаборатории в качестве постдока.

Основным преимуществом анализа нейтрализации псевдовируса по сравнению с существующими методами, такими как анализ нейтрализации на основе живого вируса, является относительная безопасность данной методики. Она не требует использования инфекционного вируса SARS и может быть проведена в лаборатории с уровнем биологической безопасности ниже третьего. Процедуру будет демонстрировать Лейинг Ду; Ду — научный сотрудник моей лаборатории, специализирующаяся на разработке вакцин против новых инфекционных заболеваний, таких как SARS и грипп. Разморозьте аликвоты стерильного 2X HBBS буфера pH 7, 2,5 M хлорида кальция и плазмиды RBD при комнатной температуре.

После размораживания растворов перенесите 2 мл 2X HBS в коническую пробирку объемом 50 мл. В пробирке объемом 15 мл смешайте 200 µL хлорида кальция с 40 µg плазмиды RBD. С помощью стерильной пипетки объемом 5 мл доведите общий объем до 2 мл, используя стерильную дистиллированную воду комнатной температуры. По каплям добавьте раствор плазмиды к 2X HBS, подвергая смесь постоянному, но осторожному перемешиванию на вортексе.

Медленное и непрерывное перемешивание в вихре крайне важно для получения преципитата подходящей консистенции, обеспечивающей высокую эффективность трансфекции. Выдержите смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации добавьте смесь по каплям в колбу с клетками 2 9 3 T с конфлюэнтностью от 50 до 70%.

При объеме 40 миллилитров среды для культивирования клеток важно равномерно распределить раствор для трансфекции. Перемешайте среду сразу после добавления трансфекционной смеси. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% углекислого газа.

После 8–10 часов инкубации удалите всю клеточную среду и замените ее 50 миллилитрами свежей среды Optimum, не содержащей сыворотки, чтобы избежать влияния сыворотки на последующую очистку белка, а затем верните клетки в инкубатор при 37 °C. Через два дня соберите супернатант, содержащий экспрессированный белок RBD, и центрифугируйте его в течение 15 минут при 6 000 об/мин для удаления клеточного дебриса. После осаждения клеток перенесите супернатант в чистую пробирку и добавьте коктейль ингибиторов протеаз.

Чтобы предотвратить деградацию белка, используйте колонки nickel NTA super flow в соответствии с инструкциями производителя для очистки рекомбинантного белка RBD из собранного супернатанта. Элюируйте белок RBD буфером, содержащим 250 millimolar ole. Затем, используя пробирки Emon Ultra 15, сконцентрируйте очищенный белок, содержащий OLE, путем центрифугирования при 3000 RPM и четырех градусах Celsius в течение примерно 15 минут. Удалите фильтрат.

Добавьте PBS в пробирки с концентратом RBD и снова центрифугируйте при 3000 об/мин при 4 °C в течение 20 минут. Повторите промывку дважды. Чтобы гарантировать полное удаление всего очищенного белка, растворите его в PBS и перенесите белок пипеткой в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Наконец, определите концентрацию очищенного белка с помощью NanoDrop, используя PBS в качестве холостой пробы, и храните образец при температуре -80 °C. Сначала добавьте 1 мл стерильного PBS в один флакон системы адъювантов Sigma. Предварительно прогрейте в водяной бане при температуре 40–45 °C и тщательно перемешайте содержимое флакона на вортексе в течение двух-трех минут.

Затем приготовьте эмульсию белкового адъюванта в пробирке типа «эппендорф» объемом 1,5 мл. Смешайте необходимое количество размороженного очищенного белка, разведенного в PBS, с равным объемом системы адъюванта и интенсивно перемешивайте на вортексе в течение двух-трех минут. Также приготовьте контрольные эмульсии, смешав адъювант только с PBS. Вводите подкожно.

Введите как минимум пяти мышам линии BC в возрасте от четырех до шести недель по 200 мкл начальной иммунизационной смеси, содержащей 20 мкг белка на дозу, или контрольную эмульсию подкожно через 21 день после первой инокуляции. Введите бустерные дозы, содержащие 10 мкг белка в конечном объеме 200 мкл каждая. Соберите образцы крови у каждой мыши перед первой иммунизацией и через 10 дней после каждой вакцинации; выделенную сыворотку храните при температуре -20 °C после нагрева.

Инактивация комплемента при 56 °C в течение 30 минут за 16 часов до трансфекции. Высейте клетки 293T в 100-мм чашки для культивирования тканей с плотностью 2 миллионов клеток на чашку. Приготовьте реагент для трансфекции, как описано ранее, и проведите ко-трансфекцию клеток плазмидой, кодирующей S-белок SARS-CoV, и другой плазмидой, кодирующей дефектный по ENV геном HIV-1, экспрессирующий люциферазу. Через 8–10 часов после трансфекции.

Замените среду на 10 milliliters свежей среды DMEM, содержащей 10% сыворотки, после чего верните клетки в инкубатор. Через два дня соберите супернатант, содержащий псевдовирус SARS. Пропустите супернатант через шприцевой фильтр с порами 0.45 micron для удаления клеточного дебриса и разлейте вирус по аликвотам.

Используйте немедленно или заморозьте при -80 °C для последующего использования с помощью многоканального планшетного пипеточного дозатора. Высейте клетки 2 9 3 T, экспрессирующие рецептор ACE2 SARS-CoV, в 96-луночный планшет для культивирования тканей в концентрации 10 000 клеток на 100 µL на лунку и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 16 часов. Используйте отдельный 96-луночный планшет для титрования рекомбинантного люцифераза-экспрессирующего псевдовируса SARS, чтобы определить подходящую концентрацию вируса для анализа нейтрализации в рядах A и B первого планшета.

150 µL 10% F-B-S-D-M-E-M в каждую лунку. Затем добавьте 150 µL неразбавленного вируса в лунки A1 и B1 и выполните серийное двухкратное разведение в дубликатах, перенося по 150 µL из лунок первой строки в лунки следующей строки и так далее до 11-й строки. Удалите последние 150 µL; вирус в лунки 12-й строки не добавляйте.

После выполнения серийных разведений и инкубации клеток ACE 2 93 T в течение 16 часов проведите заражение клеток, перенеся по 100 microliters из каждой лунки планшета с вирусом в соответствующую лунку планшета с клетками. Инкубируйте клетки в течение двух дней при 37 degrees Celsius, чтобы вирусы могли заразить клетки. Определите уровень заражения в каждой лунке, считав показания планшета на люминометре ultra 3 84.

Степень заражения пропорциональна интенсивности люциферазной активности. В анализе на нейтрализацию будет использована концентрация вируса, при которой относительные единицы люминесценции (RLU) примерно в тысячу раз превышают фоновый уровень RLU только клеток в колонке 12. Сначала подготовьте тест на нейтрализацию в отдельном 96-луночном планшете, используя многоканальный дозатор: внесите 150 µL 10% FBS-DMEM в лунки первой колонки и по 120 µL в лунки остальных колонок.

Затем добавьте по три микролитра каждой исследуемой сыворотки мыши в дублирующие лунки первого столбца. В данном примере в первые две лунки добавлена сыворотка мыши, иммунизированной RBD, в 50-кратном разведении. В следующие две лунки добавлена сыворотка второй мыши, иммунизированной RBD, а в последние четыре лунки — сыворотки двух контрольных животных, иммунизированных PBS. С помощью многоканального дозатора выполните пятикратное серийное разведение сыворотки, перенося по 30 микролитров из всех лунок первого столбца в лунки второго столбца, и повторяйте эту процедуру до 11-го столбца.

Удалите оставшиеся 30 µL; лунки в колонке 12 должны остаться без сыворотки. Затем добавьте по 120 µL разведенного псевдовируса SARS в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение одного часа, чтобы антитела к RBD в сыворотке мыши могли связать и нейтрализовать псевдовирус SARS.

После инкубации перенесите по 100 µL нейтрализованного вируса из каждой лунки в соответствующие лунки 96-луночного планшета, содержащего клетки 2 9 3 T, экспрессирующие ACE2. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 24 часов для осуществления инфицирования. После инфицирования клеток удалите супернатант с помощью многоканального дозатора и замените его 100 µL свежей среды на лунку.

Верните планшет в инкубатор на 72 часа при 37 °C. Снова удалите супернатант. К этому моменту любой псевдовирус, который не был нейтрализован сывороткой мыши, должен был инфицировать клетки. С помощью многоканального дозатора добавьте по 60 µL реагента для лизиса клеток с люциферазой в каждую лунку.

Поместите планшет на шейкер при комнатной температуре и оставьте клетки для лизиса на один-два часа. После лизиса клеток перенесите 50 µL клеточных лизатов в 96-луночный планшет для люминометра и добавьте по 50 µL субстрата люциферазы в каждую лунку. Используйте люминометр Ultra 3 84, настроенный в режиме люминесценции для 96-луночных планшетов, чтобы считать данные и оценить относительную активность люциферазы в различных лунках, на основании чего можно будет рассчитать процент нейтрализации вируса.

Эти данные показывают, что процент нейтрализации вируса пропорционален концентрации сыворотки мышей, иммунизированных RBD. Напротив, сыворотка животных, которым вводили PBS, не нейтрализует вирус ни при какой из представленных концентраций. На основании этих данных можно легко определить NT 50 или титр сыворотки, при котором нейтрализуется 50% вируса.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что уверенность и терпение являются залогом успешности экспериментов. После просмотра этих видеороликов вы должны лучше понимать, как экспрессировать рекомбинантную вакцину против SARS в субкультуре клеток млекопитающих и определять способность индуцировать ответ нейтрализующих антител на моделях мышей.