Протокол Рекомбинантный РосБР основе вакцины атипичной пневмонии: белковый препарат, вакцинация животных и нейтрализации Обнаружение

В данной процедуре подготавливают рекомбинантную вакцину, экспрессирующую белок RBD SARS COV, и оценивают её способность индуцировать нейтрализующую активность против псевдовируса SARS. Сначала белок RBD экспрессируют и выделяют из супернатанта культуры трансфицированных клеток 2 9 3 T. Затем очищенный белок используют для иммунизации.

Мыши и сыворотки собирают у вакцинированных мышей в разные моменты времени после иммунизации для количественного определения нейтрализующего потенциала иммунных сывороток. Проводится анализ нейтрализации псевдовирусов: производится рекомбинантный псевдовирус sars, экспрессирующий люциферазу, который затем инкубируют с титрованной сывороткой мыши. Затем оценивают способность этих нейтрализованных вирусов инфицировать клетки, экспрессирующие ко-рецептор ACE для SARS, путем измерения относительной активности люциферазы в инфицированных клетках.

Затем можно рассчитать титр 50% нейтрализующих антител. Меня зовут Ту. В настоящее время я работаю в лаборатории в качестве почтового сотрудника.

Основным преимуществом анализа нейтрализации псевдовирусов по сравнению с существующими методами, такими как анализы нейтрализации на основе живого вируса, является относительная безопасность данной методики. Она не требует использования инфекционного вируса SARS и может быть проведена в лаборатории с уровнем биологической безопасности ниже третьего. Демонстрировать процедуру будет Лей Юй; Лей Юй — постдокторант в моей лаборатории, чья работа сосредоточена на разработке вакцин против возникающих инфекционных заболеваний, таких как SARS и грипп. Разморозьте аликвоты стерильного 2X HBBS буфера, pH 7, 2.5 M хлорида кальция и плазмиды RBD при комнатной температуре.

После размораживания растворов перенесите 2 мл 2X HBS в коническую пробирку объемом 50 мл; в пробирку объемом 15 мл смешайте 200 µL хлорида кальция с 40 µg плазмиды RBD. С помощью стерильной пипетки объемом 5 мл доведите объем до 2 мл, используя стерильную дистиллированную воду комнатной температуры. По каплям добавьте раствор плазмиды к 2X HBS, постоянно и осторожно перемешивая смесь на вортексе.

Поддержание медленного и непрерывного перемешивания в вихре крайне важно для получения осадка подходящей консистенции, что обеспечит высокую эффективность трансфекции. Выдержите смесь в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации по каплям добавьте смесь в колбу, содержащую клетки 2 9 3 T с конфлюэнтностью от 50 до 70%.

При объеме 40 мл среды для культивирования клеток важно равномерно распределить раствор для трансфекции. Перемешайте среду сразу после добавления смеси для трансфекции. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.

После инкубации в течение 8–10 часов удалите полную питательную среду и замените ее 50 миллилитрами свежей среды Optimum, не содержащей сыворотки, чтобы избежать влияния сыворотки на последующую очистку белка, после чего верните клетки в инкубатор при 37 °C. Через два дня соберите супернатант, содержащий экспрессированный белок RBD, и центрифугируйте его в течение 15 минут при 6 000 об/мин для удаления клеточного дебриса. После осаждения клеток перенесите супернатант в новую пробирку и добавьте коктейль ингибиторов протеаз.

Чтобы предотвратить деградацию белка, используйте колонки Nickel NTA Superflow в соответствии с инструкциями производителя для очистки рекомбинантного белка RBD из собранного супернатанта. Элюируйте белок RBD буфером, содержащим 250 мM имидазола. Затем, используя центрифужные концентраторы Amicon Ultra 15, сконцентрируйте очищенный белок с имидазолом путем центрифугирования при 3000 об/мин и 4 °C в течение примерно 15 минут. Удалите фильтрат.

Добавьте PBS в пробирки с концентратом RBD и снова центрифугируйте при 3000 об/мин при температуре 4 °C в течение 20 минут. Повторите промывку дважды. Для обеспечения полного удаления остатков белок теперь растворяют в PBS; перенесите белок пипеткой в чистую пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл.

Наконец, определите концентрацию очищенного белка с помощью NanoDrop, используя PBS в качестве холостой пробы, и храните образец при температуре -80 °C. Сначала добавьте 1 mL стерильного PBS в один флакон с адъювантной системой Sigma. Предварительно прогрейте в водяной бане при температуре от 40 до 45 °C и тщательно перемешайте содержимое флакона на вортексе в течение двух-трех минут.

Затем приготовьте эмульсию белкового адъюванта в пробирке типа «ейнор» объемом 1,5 мл. Смешайте необходимое количество размороженного очищенного белка, разведенного в PBS, с равным объемом системы адъюванта и интенсивно перемешайте на вортексе в течение двух-трех минут. Также приготовьте контрольные эмульсии, смешав адъювант только с PBS. Подкожно.

Введите по крайней мере пяти мышам линии BC в возрасте от четырех до шести недель по 200 microliters исходной иммунизационной смеси, содержащей 20 micrograms белка на дозу, или контрольную эмульсию подкожно через 21 день после первоначального введения. Введите бустерные дозы, содержащие 10 micrograms белка в конечном объеме 200 microliters каждая. Соберите образцы крови у каждой мыши перед первичной иммунизацией и через 10 дней после каждой вакцинации, затем храните выделенную сыворотку при температуре minus 20 degrees Celsius после нагрева.

Инактивация комплемента при 56 °C в течение 30 минут за 16 часов до трансфекции; посев клеток 293T в 100-миллиметровые чашки для культивирования тканей с плотностью 2 миллиона клеток на чашку. Подготовьте реагент для трансфекции согласно описанному ранее методу и проведите ко-трансфекцию клеток плазмидой, кодирующей S-белок SARS-CoV, и другой плазмидой, кодирующей дефектный по белку ENV геном ВИЧ-1, экспрессирующий люциферазу. Через 8–10 часов после трансфекции.

Замените среду на 10 milliliters свежей среды DMEM, содержащей 10% сыворотки, после чего верните клетки в инкубатор. Через два дня соберите супернатант, содержащий псевдовирус SARS. Пропустите супернатант через шприцевой фильтр с порами 0.45 micron для удаления клеточного дебриса и разлейте вирус по аликвотам.

Используйте немедленно или заморозьте при -80 °C для последующего использования с помощью многоканального дозатора. Расселите клетки 2 9 3 T, экспрессирующие рецептор ACE2 вируса SARS-CoV, в 96-луночный планшет для культивирования тканей с концентрацией 10 000 клеток на 100 µL на лунку и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 16 часов. Используйте отдельный 96-луночный планшет для титрования рекомбинантного люциферазоэкспрессирующего псевдовируса SARS, чтобы определить подходящую концентрацию вируса для анализа нейтрализации в рядах A и B первого планшета.

150 мкл в каждую лунку 10% F-B-S-D-M-E-M. Затем добавьте 150 мкл неразбавленного вируса в лунки A1 и B1 и выполните серийное двукратное разведение в двух повторностях, перенося по 150 мкл из лунок первой строки в лунки следующей строки и так далее до 11-й строки. Удалите последние 150 мкл; в лунки 12-й строки вирус не добавляйте.

После проведения серийных разведений и инкубации клеток ACE 2 93 T в течение 16 часов инфицируйте клетки, перенеся 100 µL из каждой лунки планшета с вирусом в соответствующую лунку планшета с клетками. Инкубируйте клетки в течение двух дней при 37 °C, чтобы вирусы могли инфицировать клетки. Определите уровень инфекции в каждой лунке, считав сигнал с планшета на люминометре ultra 3 84.

Степень инфицирования пропорциональна интенсивности люциферазной активности. Концентрация вируса, при которой относительные единицы люминесценции (RLU) примерно в тысячу раз превышают фоновый уровень RLU клеток в колонке 12, будет использована в анализе нейтрализации. Сначала подготовьте планшет для нейтрализации в отдельном 96-луночном планшете, используя многоканальный пипетку: внесите 150 µL 10% F-B-S-D-M-E-M в лунки первой колонки и по 120 µL в лунки остальных колонок.

Затем добавьте по 3 µL каждой исследуемой сыворотки мыши в дубликатные лунки первого столбца. В данном примере в первые две лунки добавлена сыворотка мыши, иммунизированной RBD, в 50-кратном разведении. В следующие две лунки добавлена сыворотка второй мыши, иммунизированной RBD, а в последние четыре лунки — сыворотки двух контрольных животных, иммунизированных PBS. Используя многоканальный пипетку, выполните пятикратное серийное разведение сыворотки, перенося по 30 µL из всех лунок первого столбца в лунки второго столбца; повторяйте эту процедуру до 11-го столбца.

Удалите оставшиеся 30 µL, оставив лунки в колонке 12 без сыворотки. Затем добавьте в каждую лунку по 120 µL разведенного псевдовируса SARS. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение одного часа, чтобы антитела к RBD в сыворотке мыши могли связать и нейтрализовать псевдовирус SARS.

После этой инкубации перенесите 100 µL нейтрализованного вируса из каждой лунки в соответствующие лунки 96-луночного планшета, содержащего клетки 2 9 3 T, экспрессирующие ACE2. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 24 часов для обеспечения инфицирования; после инфицирования клеток удалите супернатант с помощью многоканального дозатора и замените его 100 µL свежей среды на лунку.

Верните планшет в инкубатор на 72 часа при 37 °C. Снова удалите супернатант. К этому моменту любые псевдовирусы, которые не были нейтрализованы сывороткой мыши, должны были успеть инфицировать клетки. С помощью многоканального дозатора добавьте по 60 µL реагента для лизиса культур клеток с люциферазой в каждую лунку.

Поместите планшет на шейкер при комнатной температуре и дайте клеткам лизироваться в течение одного-двух часов. После лизиса клеток перенесите 50 µL клеточных лизатов в 96-луночный планшет для люминометра и добавьте по 50 µL субстрата люциферазы в каждую лунку. Используйте люминометр Ultra 3 84, настроенный на измерение люминесценции в 96-луночных планшетах, чтобы считать планшет и оценить относительную активность люциферазы в различных лунках, на основании чего можно рассчитать процент нейтрализации вируса.

Эти данные показывают, что процент нейтрализации вируса пропорционален концентрации сыворотки мышей, иммунизированных RBD. Напротив, сыворотка животных, которым вводили PBS, не нейтрализует вирус ни при какой концентрации, согласно этим данным. NT₅₀ или титр сыворотки, при котором нейтрализуется 50% вируса, может быть легко рассчитан.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что уверенность и терпение имеют решающее значение для успеха экспериментов. После просмотра этих видеороликов вы должны лучше понять, как экспрессировать рекомбининтную вакцину против SARS в субкультуре клеток млекопитающих и определять способность индуцировать ответ нейтрализующих антител на мышиных моделях.