Протокол Рекомбинантный РосБР основе вакцины атипичной пневмонии: белковый препарат, вакцинация животных и нейтрализации Обнаружение

В ходе этой процедуры получают рекомбинантную вакцину, экспрессирующую белок SARS COV RBD, и оценивают ее способность индуцировать нейтрализующую активность в отношении псевдовируса SARS. Первый. Белок RBD экспрессируется в выделенной из культуры надосадочной жидкости трансфицированных 2, 9, 3 Т-клеток. Очищенный белок затем используется для иммунизации.

Мышей и сыворотки крови собирают у вакцинированных мышей в различные моменты времени после иммунизации для количественной оценки нейтрализационного потенциала иммунной сыворотки. Проводится анализ псевдонейтрализации вируса, производится рекомбинантная продуцируемая люцифераза, экспрессирующий псевдовирус SARS, и инкубируется с титруемым ртом sra. Затем оценивается способность этих нейтрализованных вирусов инфицировать клетки, экспрессирующие ко-рецептор SARS АПФ, путем измерения относительной активности люциферазы в инфицированных клетках.

Затем можно рассчитать титр нейтрализующих антител на 50%. Меня зовут ту. В настоящее время я работаю почтальоном в лаборатории.

Основное преимущество псевдовирусной нейтрализации по сравнению с существующими методами, такими как анализы нейтрализации живых вирусов, заключается в том, что этот метод относительно безопасен. Не требует инфекционного вируса SAR и может быть выполнен в трех лабораториях, не являющихся безопасными. Мое имя демонстрирует, что процедура будет отложена, и DU является научным сотрудником в моей лаборатории, который сосредоточился на разработке вакцины против новых инфекционных заболеваний, таких как SARS и Infl Thaw аликвоты стерильных двух буферных XHBS pH 7 2,5 молярного хлорида кальция и плазмиды RBD при комнатной температуре.

Как только растворы разморозятся, перелейте два миллилитра двух XHBS в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, в пробирке объемом 15 миллилитров смешайте 200 микролитров хлорида кальция с 40 микрограммами плазмиды RBD. Отрегулируйте объем до двух миллилитров с помощью стерильной дистиллированной воды комнатной температуры с помощью стерильной пятимиллилитровой пипетки. Добавьте плазмидный раствор к двум XHBS по каплям, поддерживая смесь в постоянном, но мягком вихре

Поддержание этого вихря медленным и непрерывным имеет решающее значение для получения осадка достаточной консистенции для высокой эффективности трансфекции. Хранить 20 минут при комнатной температуре. После этой инкубации добавляйте смесь по каплям в колбу, содержащую от 50 до 70% конфлюентных 2 9 3 Т-клеток.

В объеме 40 миллилитров среды для клеточных культур важно равномерно распределить трансфекционный раствор. Перемешивайте среду сразу после добавления трансфекционной смеси. Поместите клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с 5% углекислым газом.

После восьми-10 часов инкубации удалите всю клеточную среду и замените ее 50 миллилитрами свежей сыворотки без оптимального значения, одной средой, чтобы избежать любого вмешательства сыворотки в последующую очистку белка, а затем верните клетки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Через два дня соберите надосадочную жидкость, которая будет содержать экспрессированный белок RBD, и центрифугируйте через 15 минут при 6000 об/мин для удаления клеточного мусора. После того, как клетки будут гранулированы, перенесите супернат в свежую пробирку и добавьте коктейль ингибиторов протеазы.

Чтобы предотвратить деградацию белка, используйте Nickel NTA superflow в соответствии с инструкциями производителя для очистки рекомбинантного белка RBD из собранного белка supernat ELUTE RBD с буфером, содержащим 250 миллимолярного оле. Затем с помощью пробирок Emon Ultra 15 сконцентрируйте очищенный белок, содержащий OLE, путем центрифугирования при 3000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение примерно 15 минут. Откажитесь от сквозного потока.

Добавьте PBS в пробирки для концентрации RBD и снова центрифугируйте при 3000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Повторите стирку дважды. Чтобы обеспечить полное удаление оле, очищенный белок теперь растворяется в пипетке PBS в чистой пробирке EOR объемом 1,5 миллилитров

Наконец, рассчитайте концентрацию очищенного белка с помощью NanoDrop с PBS в качестве заготовки и храните образец при температуре минус 80 градусов Цельсия. Сначала добавьте один миллилитр стерильного PBS в один флакон адъювантной системы Sigma. Разогрейте на водяной бане при температуре от 40 до 45 градусов Цельсия и тщательно перебейте флакон в течение двух-трех минут.

Далее приготовьте белковую адъювантную эмульсию в тюбике эйнора объемом 1,5 миллилитров. Смешайте нужное количество размороженного очищенного белка, разведенного в ПБС, с равным объемом адъювантной системы и энергично перемешайте в течение двух-трех минут. Кроме того, приготовьте контрольные эмульсии, смешав адъювант только с PBS. Подкожно.

Введите по меньшей мере пяти мышам в возрасте от четырех до шести недель по 200 микролитров каждой из первоначальной иммунизационной смеси, содержащей 20 микрограммов белка на дозу, или контрольную эмульсию через 21 день после первоначальной прививки подкожно. Вводите бустерные дозы, содержащие 10 микрограммов белка в конечном объеме 200 микролитров каждая. Соберите образцы крови у каждой мыши до первоначальной иммунизации и через 10 дней после каждой вакцинации и храните изолированную сыворотку при температуре минус 20 градусов Цельсия после нагревания.

Инактивация комплемента при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут за 16 часов до трансфекционной пластины 2 9 3 Т-клеток в 100-миллиметровых чашках для культуры тканей с плотностью 2 миллиона клеток на чашку. Приготовьте реагент для трансфекции, как описано выше, и проведите трансфекцию клеток плазмидой, кодирующей S-белок SARS cove, и другой плазмидой, кодирующей дефектную ENV люциферазу, экспрессирующую ВИЧ, один геном. От восьми до 10 часов после трансфекции.

Замените среду на 10 миллилитров свежей среды DMEM, содержащей 10% сыворотки, а затем верните клетки в инкубатор. Через два дня соберите побег, содержащий псевдовирус SARS. Пропустите надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить клеточный мусор от вируса.

Используйте немедленно или заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования с помощью многоканальной пипетки. 2 9 3 Т-клетки, экспрессирующие рецептор SARS COV ACE два в 96 лунках тканевую культуральную пластину в концентрации 10 000 клеток на сто микролитров на лунку и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов. Используйте отдельную 96-луночную пластину для титрования рекомбинантной люциферазы, экспрессирующей псевдовирус SARS, и определите подходящую концентрацию вируса для анализа нейтрализации в строках А и В первой пластине.

150 микролитров на лунку 10% F-B-S-D-M-E-M. Затем добавьте 150 микролитров неразбавленного вируса в ряды А 1 и В 1 и выполните повторное серийное двукратное разбавление, перенеся более 150 микролитров из лунок в первом ряду в лунки следующего ряда и так далее до 11 ряда. Отбросьте последние 150 микролитров и не добавляйте вирус в строку 12.

После того, как последовательное разведение было выполнено и ACE 2 93 Т-клетки были инкубированы в течение 16 часов, инфицируйте клетки, переливая 100 микролитров из каждой лунки вирусной пластины в соответствующую лунку пластины, содержащей клетки. Инкубируйте клетки в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы вирусы могли заразить клетки. Определите уровень инфекции в каждой лунке, сняв показания с планшета люминометр ультра 3 84

Количество инфекции пропорционально интенсивности активности люциферазы. В анализе нейтрализации будет использована концентрация вируса, при которой относительная единица люциферазы примерно в тысячу раз превышает фоновую RLU только клеток в столбце 12. Настройте нейтрализацию в отдельной 96-луночной пластине сначала с помощью многоканальной пипетки на 150 мкл 10% F-B-S-D-M-E-M в лунки в одной колонне и 120 мкл в лунки в остальных колоннах.

Затем добавьте по три микролитра каждой тестируемой сыворотки мыши, чтобы дублировать лунки в первом столбце. В этом примере в первых двух лунках содержится 50-кратная разведенная сыворотка от мыши, иммунизированной RBD. Следующие две лунки получают сыворотку от второй иммунизированной мыши RBD, а последние четыре лунки получают сыворотку от двух контрольных PBS иммунизированных животных с помощью многоканальной пипетки, выполняют пятикратное серийное разведение сыворотки путем переноса 30 микролитров из всех лунок в первой колонке в лунки второй колонки и повторяют это до колонки 11.

Выбросьте оставшиеся 30 микролитров и оставьте лунки в столбце 12 без сыворотки. Далее добавьте в каждую лунку по 120 микролитров разведенного псевдовируса SAR. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы любые антитела против RBD в сыворотке мыши могли связать и нейтрализовать псевдовирус SARS.

После этой инкубации перенесите по 100 микролитров обезвреженного вируса из каждой лунки в соответствующие лунки. 96-луночный планшет, содержащий АПФ 2, экспрессирующие 2, 9, 3 Т-клетки. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, чтобы обеспечить инфекцию после того, как клетки были инфицированы, удалите сажу и с помощью многоканальной пипетки замените ее 100 микролитрами на лунку свежей среды.

Верните тарелку в инкубатор через 72 часа при температуре 37 градусов Цельсия. На этом этапе любой псевдовирус, который не был нейтрализован сывороткой мыши, должен был иметь возможность заражать клетки с помощью многоканальной пипетки. Добавьте 60 микролитров на лунку одного реагента для лизиса клеточной культуры люциферазы.

Поместите пластину на шейкер при комнатной температуре и дайте клеткам лизироваться в течение одного-двух часов. После того, как клетки будут заморожены, перенесите 50 микролитров клеточных лизатов в 96-луночный люминометром и добавьте 50 микролитров люциферазного субстрата на лунку. Используйте люминометр ultra 3 84, установленный в режиме люминесценции в режиме 96 луночных планшетов, чтобы считывать показания планшета и оценивать относительную активность люциферазы в различных лунках, из которых можно получить процент нейтрализованного вируса.

Эти данные показывают, что процент достигнутой нейтрализации вируса пропорционален концентрации сыворотки крови от иммунизированных мышей RBD. Напротив, сыворотка от животных, которым вводили PBS, не может нейтрализовать вирус в любой концентрации из этих данных. NT 50 или сывороточный титр, при котором нейтрализуется 50% вируса, может быть легко получен

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что уверенность и терпение необходимы для успеха экспериментов. После просмотра этих видео у вас должно быть лучшее понимание того, как экспрессировать рекомбинантную вакцину против SARS в субпродуктах клеток maman, а также определить способность индуцировать ответ нейтрализованных антител на мышиных моделях.