Светоактивированная обработка бактериальных биопленок с использованием фотосенсибилизирующего прекурсора

Начинайте с микропластинчатых колодц, содержащих биопленки патогенной бактерии, разделённых на четыре экспериментальные группы.

Аккуратно аспирируйте среду и прополосните буфером, чтобы удалить неприлипшие клетки.

Добавьте буфер с прекурсором фотосенсибилизатора в две группы, в то время как оставшиеся две получают буфер отдельно.

Инкубировать все группы в темноте, чтобы прекурсор мог диффундировать через биопленку, проникнуть в бактериальные клетки и метаболизироваться в фотосенсибилизатор, который накапливается в цитоплазме и мембранах.

После инкубации подвергайте одну группу, обработанную прекурсором, и одну группу, содержащую только буфер, световому облучению.

В группе, обработанной прекурсором, свет возбуждает фотосенсибилизатор, который передаёт энергию молекулярному кислороду и генерирует реактивные кислородные формы (ROS).

ROS разрушает мембраны, разрушает белки и фрагментирует ДНК, что приводит к гибели бактериальных клеток.

Остальные три условия не вызывают ROS, так как либо прекурсор, либо свет отсутствуют, и биопленка остаётся незатронутой.

Для получения биопленки в пластине на 96 лунок сначала инокулятируйте один минус 80 градусов Цельсия, разморозив Staphylococcus aureus в США триста в трёх биопленках, образуя клинические культуры штама в отдельные 14-миллилитровые трубки с круглым дном, содержащие пять миллилитров триптонового соевого бульона, или среды TSB, в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с ночным встряхиванием. Когда культуры достигнут стационарной фазы, центрифугуйте бактериальные клетки и снова суспензуйте гранулы и PBS до 2 раза 10 единицы для девятой колонии на концентрацию на миллилитр. Разведите эти бактериальные суспензии в соотношении 1 к 200 и в среде TSB, дополненную нулевым целым пятипроцентным содержанием глюкозы и посеянными 200 микролитрами бактериальных клеток на каждую скважину в три колодца на штамм на экспериментальную группу в обработанной 96-луночной микропластине для 24-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия, с кислородом, без дрожи.

На следующий день аккуратно промой колодцы три раза с помощью PBS, не трогая биопленки. Затем добавьте 200 микролитров свежеприготовленного ALA в соответствующие экспериментальные скважины и поставьте пластину при 25 градусах Цельсия на один час, защищённую от света. Затем облучите пластину светоизлучающим диодом с интенсивностью света 100 милливатт на квадратный сантиметр в течение одного часа.