Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Общая цель этой процедуры заключается в выделении митохондрий и проведении митохондриального дыхания. Это достигается путем первичной изоляции скелетных мышц от распыляемых крыс. Затем мышца гомогенизируется и митохондрии изолируются с помощью центрифугирования.

Затем концентрацию белка определяют с помощью анализа Брэдфорда. Наконец, митохондриальное дыхание измеряется с помощью полиграфии. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие потребление кислорода в различных состояниях митохондриального дыхания.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области скелетных мышц, такие как влияние различных вмешательств на функцию митохондрий. Хотя этот метод может дать представление о метаболизме скелетных мышц, он также может быть применен к другим органам, таким как печень, мозг, почки или почти любая ткань перед началом процедуры. Чтобы изолировать скелетные мышцы, приготовьте следующие растворы: P-B-S-P-B-S плюс 10 миллимоляров ЭДТА, восьмикратный изолирующий буфер митохондрий один или IB один, изоляционный буфер два или IB два и экспериментальный буфер или eb.

Инструкции см. в прилагаемом письменном протоколе. Далее включите центрифугу и установите ее на четыре градуса Цельсия. Включите водяную баню и установите ее на 37 градусов Цельсия.

В красивое ведро положите три 10-миллилитровых стакана, гончарный локоть, измельчители для драгоценных камней, маленькие хирургические ножницы и 10 микроцентрифужных пробирок на лед. Все должно оставаться ледяным на протяжении всего эксперимента. Поместите IB 1 и IB 2 на ICE и EB в теплую водяную баню.

Затем добавьте следующие растворы к трем стаканам для льда: один 10 миллилитров стакана PBS, два 10 миллилитров стакана P-B-S-E-D-T-A. Три. Три миллилитра ib. Усыпьте крысу в соответствии с процедурами, утвержденными местным комитетом по уходу за животными и сокам.

Затем быстро изолируют от 250 до 500 мг скелетной мускулатуры с помощью щипцов и ножниц клиники майонеза. Промойте его в бека один, затем переложите в бека два, чтобы гомогенизировать мышцу. Сначала переложите его в стакан три, а затем пропустите через мясорубку ножницами.

Переложите раствор в гончарный гомогенизатор драгоценных камней Elva, гомогенизируйте мышцы с помощью моторизованного пестика 10 раз, постоянно удерживая трубку во льду. Затем перенесите гомогенат в предварительно охлажденную двухмиллилитровую микроцентрифугу, пробирки и центрифугу при температуре 700 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость S в новую предварительно заполненную микроцентрифужную пробирку и выбросьте центрифугу для гранул.

Надосадочная жидкость S при 10 500 G в течение 10 минут При четырех градусах Цельсия перенесите SNAT в новую предварительно заполненную микроцентрифужную пробирку и пометьте ее SN One и мышечным типом Риза. Суспензируйте гранулу в 500 микролитрах IB два, затем центрифугируйте при 10, 500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супинат в новую предварительно заполненную микроцентрифужную пробирку и пометьте ее SN two и мышечным типом.

Суспендируйте окончательную митохондриальную гранулу в 100 микролитрах IB два. Вращайте его в мини фуге в течение нескольких секунд. Если есть гранула, перенесите супинат в новую предварительно заполненную микроцентрифужную трубку и выбросьте гранулу Калибровка кислородного электрода является ключевым этапом в этом протоколе и должна выполняться ежедневно.

Калибровка электрода может быть завершена во время митохондриальной изоляции. Для начала добавьте 100 миллилитров дистиллированной воды в колбу объемом 250 миллилитров энергично в течение 20 минут. Чтобы уравновесить воду с атмосферным газом, накройте электрод GRAT несколькими каплями 50% хлорида калия.

Затем положите небольшой кусочек синей рулонной бумаги ризла поверх электрода. Затем кусок мембраны из ПТФЭ. Сверху на рулонную бумагу.

Наденьте внутреннее кольцо с помощью кольцевого аппликатора, а затем поместите внешнее кольцо в канавку электрода. Соедините электроды и соберите большее пластиковое кольцевое основание, митохондриальную камеру и водяные шланги. Включите коробки GRAT и запустите программное обеспечение GRAS.

Добавьте уравновешенную воду в митохондриальную камеру. Затем добавьте полосу перемешивания, чтобы включить полосу перемешивания. Нажмите на оборудование.

Затем перемешайте скорость. Отрегулируйте скорость на 60 и нажмите на. Далее начните новый эксперимент.

Нажмите на калибровку, а затем на калибровку жидкой фазы. В первом поле измените температуру на 37 градусов по Цельсию и дважды нажмите OK. Когда переопределение изменится на, хорошо, нажмите на него и откройте баллон с азотом.

Поместите наконечник, соединенный с азотным баком, в камеру и установите нулевой уровень кислорода. Нажмите кнопку «ОК», когда произойдет переключение с переопределения. Аспирируйте воду и добавьте 500 микролитров БЭ в митохондриальные камеры.

Уплотните камеру с помощью поршня. Если вы используете несколько коробок, повторите шаг калибровки для каждой коробки. Запустите новый эксперимент и дайте ему поработать около одной минуты.

Чтобы стабилизировать сигнал, добавьте необходимый объем митохондриальной суспензии до 150 мкг в каждой камере. Отметьте событие и дайте ему пройтись. В течение одной минуты добавьте 10 микролитров теплого 250 миллимоларного глутамата, 125 миллимолярного малата для окончательной концентрации пяти миллимолярных глутамата, 2,5 миллимолярной отметки малата и дайте поработать в течение одной минуты.

Это состояние определяется как состояние два. Затем добавьте 7,5 микролитров 10 миллимоляров DP для конечной концентрации 150 микромоляров. Затем отметьте и дайте ему поработать в течение 30 секунд.

Это состояние определяется как состояние три. Добавьте еще 7,5 микролитров 10 миллимоляров отметки DP и дайте поработать 1,5 минуты. Добавьте 0,5 микролитра холодного 10 миллимолярного олигомицина до конечной концентрации в одну микромолярную отметку и дайте ему настояться в течение трех минут.

Это состояние определяется как состояние четыре. Добавьте один микролитр холодного 0,1 миллимоляра FCCP для конечной концентрации 0,2 микромоляра и дайте RUM настояться в течение трех минут. Это определяется как состояние пять.

Когда закончите, завершите эксперимент и сохраните его. Узнайте частоту дыхания с помощью программного обеспечения для плота. Введите коэффициент нормализации.

Если добавить 150 мкг митохондриального белка, то фактор нормализации составит 0,15. Рассчитайте нормализованную частоту дыхания для различных состояний дыхания. Рассчитайте коэффициент контроля дыхания или RCR, разделив состояние три на состояние четыре.

На этом рисунке показано репрезентативное отслеживание потребления кислорода скелетными мышцами. Митохондрии. После стабилизации электродного сигнала образец митохондрий добавляется в камеру GRAT. Состояние второе, дыхание начинается с добавления глутамата и малата.

Добавление A DP увеличивает потребление кислорода. Определение третьего состояния. Дыхание ТП-синтазы блокируется добавлением мицина лиги для получения дыхания четвертого состояния.

Наконец, FCCP добавляется для разъединения митохондриального дыхания. На этой диаграмме показаны репрезентативные нормы потребления кислорода для состояний 2, 3, 4 и 5. Коэффициент контроля дыхания или RCR рассчитывается для каждого эксперимента.

RCR больше четырех считается свидетельством жизнеспособного препарата митохондрий при попытке проведения этой процедуры. Важно всегда держать образцы митохондрий во льду. Следуя этой процедуре.

Другие методы, такие как вестерн-блоттинг, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как содержание митохондриальных белков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать митохондриальное дыхание от скелетного, а также митохондриального дыхания.