Методы развития, передающихся через кровь Перевозки из макрофагов Nanoformulated Антиретровирусные препараты

Целью данной процедуры является изготовление и тестирование клеточного поглощения, секреции и антиретровирусных свойств кристаллических антиретровирусных наночастиц, которые мы называем nano art. Это достигается путем предварительной обработки антиретровирусных препаратов с помощью ультразвуковой гомогенизации или мокрого помола. Вторым этапом процедуры является характеристика физических свойств частиц nano art после выделения первичных моноцитов методом противотокового центрифугирования.

Их культивируют в течение семи дней в среде DMEM, содержащей макрофагальный колониестимулирующий фактор (MCSF), который индуцирует их дифференцировку в макрофаги, производные моноцитов. Третьим этапом является проверка поглощения, удержания и высвобождения nano art в макрофагах, производных моноцитов человека. Заключительным этапом процедуры является проверка антиретровирусной эффективности nano art in vitro в макрофагах, производных моноцитов.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие облегченное поглощение и медленное высвобождение наночастиц из клеток, а также выраженную антиретровирусную эффективность. Эти показатели определяются путем измерения уровней препарата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и путем анализа супернатанта инфицированных культур с измерением активности обратной транскриптазы. Здравствуйте, меня зовут Ханта Алди, я постдокторант в лаборатории доктора Говарда Гелмана в Медицинском центре Университета Небраски.

Представленные нами методы могут помочь ответить на ключевые вопросы наномедицины, в том числе на вопрос о том, как системы доставки лекарств на основе клеток могут быть использованы для развития трансляционных исследований. Это может быть реализовано с помощью применения антиретровирусной терапии в наноформуляциях с пролонгированным периодом полувыведения. Наши исследования подтверждают потенциальную возможность применения нано-АРТ в клинической практике.

Здравствуйте, меня зовут Ари Ноше, я аспирант (MD PhD) из лаборатории перспективных исследований в области нейронаук имени Кэрол Шварц. Под руководством доктора Гендельмана мы изучаем применение представленных здесь методов в антиретровирусной терапии, поскольку соединения в наноформуляциях позволяют одновременно повысить биодоступность и улучшить фармакокинетику, снижая при этом побочные эффекты лекарственных средств. Перепаковывая доступные в клинике антиретровирусные препараты в наночастицы, мы сможем повысить приверженность пациентов к лечению и положительно повлиять на исходы заболевания.

Здравствуйте, я доктор Говард Гендельман. Я врач-исследователь, профессор, заведующий кафедрой фармакологии и экспериментальной нейробиологии здесь, в Медицинском центре Университета Небраски. Наша общая цель — упростить применение антиретровирусных препаратов, чтобы сделать их более доступными, а также улучшить их биораспределение и фармакокинетику.

А теперь я передаю слово Ари и Шону, которые проведут вас в исследовательскую лабораторию и покажут, как осуществляется производство и разработка этих наночастиц. Клиническая применимость и разработка здесь, в Медицинском центре Университета Небраски. Для производства наночастиц методом мокрого помола сначала взвесьте кристаллы препарата и различные поверхностно-активные вещества, которые будут использоваться для создания наноформуляций, и смешайте их с 10 mM HEPES-буфером pH 7.8 с использованием смесителя T 18 ultra Turrax до полного диспергирования; при непрерывном помоле содержание препарата в формуляции должно составлять от 1 до 2%.

Убедитесь, что чиллер и компрессор включены, а выходное давление составляет около 100 PSI; затем подготовьте систему к загрузке измельчающего тела и добавьте 50 milliliters бусин в измельчающую камеру. С помощью воронки убедитесь в отсутствии бусин на резьбе или за пределами измельчающей камеры, чтобы избежать утечек через механическое уплотнение. После этого проверьте, установлено ли уплотнительное кольцо на месте в камере измельчения.

Затем выберите подходящий размер ячейки сетки и закрепите крышки, затянув гайки. Размер ячеек сетки должен составлять не менее половины размера бусин. Используйте сетку с крупными ячейками, чтобы предотвратить засорение фильтра продуктом при непрерывном измельчении.

После опускания камеры измельчения добавьте суспензию препарата с различным количеством поверхностно-активных веществ в загрузочное отверстие. Минимальный объем суспензии должен составлять 100 milliliters. Это предотвратит перегрев камеры измельчения, а также позволит избежать загрязнения шариками за счет уменьшения износа деталей.

Затем запустите насос. Используя блок управления, установите скорость потока, необходимую для вашей рецептуры. После этого включите мешалку и отрегулируйте скорость ее вращения на блоке управления.

Скорость может быть увеличена с 600 оборотов в минуту до 4 320 оборотов в минуту. При использовании micro sur контролируйте температуру с помощью датчика, закрепленного сверху на камере измельчения, чтобы избежать перегрева. Теперь проведите помол образца при различных скоростях и скоростях потока, отбирая небольшие аликвоты формуляции объемом около 1 мл для измерения размера и заряда с помощью анализатора Malvern Zetasizer методом динамического рассеяния света.

После достижения желаемого размера частиц остановите измельчение с помощью блока управления и, не выключая насос, соберите образец в колбу, дав препарату полностью стечь. Не забудьте выключить насос по завершении, а также извлечь и очистить шарики. Теперь перенесите суспензию из мельницы в центрифужные пробирки объемом 50 мл и установите режим центрифугирования на 10 000 об/мин на 30 минут.

По завершении цикла центрифугирования измерьте объем супернатанта и замените его тем же количеством свежего раствора сурфактанта. После завершения ресуспендирования перенесите суспензию в камеру мельницы и проводите помол в течение 10 минут. Возьмите аликвоту объемом около одного миллилитра и снова измерьте размер и заряд образца с помощью Zeta sizer.

Наконец, измерьте концентрацию составов нано-арта с помощью ВЭЖХ для изготовления нано-арта методом гомогенизации. Используя Avastin Emulex C five, подготовьте кристаллы препарата и различные поверхностно-активные вещества, как было описано ранее, перенесите суспензию в сосуд для гомогенизации и начните рециркуляцию. Перед началом гомогенизации образца убедитесь, что чиллер включен.

Постепенно увеличивайте давление, пока манометр не покажет 20 000 ± 2000 PSI, и продолжайте гомогенизацию до достижения целевого размера частиц. Обычно этот процесс занимает от 45 до 60 минут. Периодически отбирайте аликвоту объемом около одного миллилитра и измеряйте размер и заряд образца гомогенизированной суспензии с помощью центрифуги с зета-сайзером, как было описано ранее.

Затем после получения суспензии Resus перенесите её в гомогенизатор C five. Возобновите циркуляцию, установите давление гомогенизации на 20 000 ± 2000 PSI и проводите гомогенизацию в течение 30 минут; для изготовления методом соникации используйте ультразвуковой процессор Cold Palmer. Влейте раствор хлорметана, PLGA и лекарственного вещества в 1% раствор ПАВ PVA и поместите в ледяную баню в ультразвуковой установке.

Начните ультразвуковую обработку при амплитуде 50%, хотя для меньших объемов образцов амплитуду можно снизить примерно до 30%; обрабатывайте образец ультразвуком в течение 10 минут. Отберите небольшую аликвоту для анализа размера частиц. Если размер частиц превышает 1.5 microns, продолжайте ультразвуковую обработку образцов с интервалом в две минуты до достижения максимального общего времени 16 минут.

Изучите образцы под микроскопом при 20-кратном увеличении и задокументируйте результаты наблюдений. Используйте магнитную мешалку для создания достаточного вихря в суспензии и продолжайте перемешивание в течение ночи при комнатной температуре. Соберите суспензию через 24 часа и перелейте ее в центрифужные пробирки объемом 50 milliliter.

Центрифугируйте образцы при скорости 8 000 об/мин в течение 20 минут при температуре 5 °C, слейте супернатант и ресуспендируйте одну половину образца в 75 мл фильтрованной воды, полученной методом обратного осмоса, а другую половину — в 75 мл 0,5% раствора ПАВ CTAB (цетилтриметиламмоний бромида). Снова центрифугируйте образцы при скорости 8 000 об/мин в течение 20 минут при температуре 5 °C и ресуспендируйте каждый осадок в общем объеме 20 мл раствора маннитола. Наконец, для частиц, полученных путем гомогенизации или соникации, измерьте размер частиц с помощью анализатора ZetaSizer и определите концентрацию образцов методом ВЭЖХ.

Для подготовки к визуализации с помощью микроскопии возьмите приготовленные суспензии нано-арта и подвергните их воздействию ультразвука в течение 10 секунд. При амплитуде 20% с использованием ультразвукового зонда возьмите покровное стекло для микроскопа и поместите его на перевернутый микроскоп. На покровном стекле.

Смешайте 15 µL суспензии наночастиц с 100 µL фосфатно-солевого буферного раствора, перемешивая содержимое несколько раз с помощью пипетирования. Затем изучите наночастицы с помощью объектива с 20-кратным увеличением для анализа морфологии. Образцы также можно подготовить для визуализации с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Здесь представлены изображения, полученные с помощью низковольтного полевого эмиссионного сканирующего электронного микроскопа A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F после выделения моноцитов из крови путем центрифугирования; очищенные моноциты в концентрации 1×10⁶ клеток/мл были перенесены в среду DMEM с соответствующими добавками. Затем в 6-луночные планшеты высевали 2×10⁶ клеток на лунку; культивирование проводили в течение семи дней в увлажненной атмосфере с добавлением 5% CO2 для дифференцировки моноцитов в макрофаги с целью последующего анализа захвата и сбора клеток. Nano art смешивали с культуральной средой до конечной концентрации 100 µM и добавляли по 1 мл среды для обработки в каждую лунку в выбранный момент времени или после полного насыщения клеток nano art.

Удалите всю среду для обработки и трижды промойте клетки 1 мл PBS, чтобы удалить частицы, которые не были поглощены клетками. Снимите адгезивные клетки со дна лунки с помощью клеточного скребка и перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 1.7 мл. Центрифугируйте клетки при 1000 RCF при температуре 4 °C в течение 10 минут.

Удалите супернатант и добавьте 200 µL 100% метанола для лизиса клеток; растворите nano art, подвергнув осадок кратковременной обработке ультразвуковым зондом при амплитуде 20% в течение двух-пяти секунд. Храните образцы при -80 °C до начала анализа содержания препарата. Внутриклеточную ретенцию nano art также можно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии после подготовки срезов на микротоме, как показано здесь.

Подробную информацию по анализу высвобождения наноарковых структур, обработке клеток, а также анализу их поглощения и сбора см. в сопроводительном тексте к данной статье. Однако вместо сбора клеток после промывки, в указанные дни или при пожелтении среды замените PBS двумя миллилитрами среды для культивирования клеток без MCSF и наноарков; в назначенный день замените половину объема среды. Соберите один миллилитр культуральной среды вместе с повторными образцами клеток и проведите анализ содержания препарата.

Для визуализации поглощения в реальном времени с помощью бифокальной микроскопии nano art сначала возьмите DRE, например, vibrant, и добавьте его в среду. Следуя инструкциям производителя, добавьте среду, содержащую краситель, к зрелым макрофагам, полученным из моноцитов, а затем трижды промойте клетки одним миллилитром культуральной среды, чтобы удалить излишки красителя. Теперь смешайте nano art с культуральной средой, используя флуоресцентно меченный nano art, и добавьте среду для обработки с меченным nano art. Непосредственно перед визуализацией с помощью конфокального микроскопа делайте снимки каждые 30 секунд в течение четырех часов, используя 60-кратный объектив.

Наконец, можно провести анализ инфицирования и инфекционности ВИЧ-1. Сначала обработайте клетки так, как описано для визуализации высвобождения артрина. Затем в выбранные дни удалите всю среду и замените ее средой без MCSF, содержащей ВИЧ-1 в множественности заражения 0,01 вирусных частиц на клетку, и инкубируйте в течение 24 часов.

Затем удалите вирусную среду и замените её свежей средой с вирусом; культивируйте клетки в течение 10 дней, заменяя половину среды каждые два дня или по мере необходимости для поддержания жизнеспособности клеток в течение 10 дней после инфицирования. Соберите по 10 µL среды из каждой лунки 96-луночного планшета и храните при температуре -80 °C до проведения анализа обратной транскриптазы. Также может быть выполнено последующее определение p24 ВИЧ-1.

Здесь мы можем отчетливо видеть морфологию клеток, подвергнутых воздействию вируса с множественностью заражения 0,011 через один день после обработки наночастицами. В этих макрофагах, полученных из моноцитов, нет признаков вирусной инфекции, а наночастицы хорошо видны в цитоплазме клеток. В данном случае воздействие вируса на клетки проводили через 10 дней после обработки наночастицами.

Некоторые из этих клеток были инфицированы, о чем свидетельствует окрашивание на P 24 и образование многоядерных гигантских клеток, однако по сравнению с необработанными клетками все еще наблюдалась значительная защита. Обратите внимание, что на изображении B в цитоплазме клеток все еще видны наночастицы, но в меньшем количестве, чем на изображении a; в клетках, которые не подвергались обработке nano art, эти структуры отсутствуют. На данных видеоконфокальной микроскопии живых клеток макрофаги помечены зеленым цветом, а nano art — красным.

Здесь видно, что в клетках накапливается очень мало наночастиц. В данном случае частицы накапливаются быстро, о чем свидетельствует усиление красной флуоресценции. Эти различия соответствуют результатам анализа поглощения лекарственного препарата. С помощью ВЭЖХ мы также можем наблюдать активный захват частиц клетками.

Разница в скоростях накопления клеточного нано-арта отражает влияние таких физических характеристик, как размер, форма и заряд, на способность макрофагов поглощать и удерживать нано-арт. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать нано-арт с помощью методов гомогенизации при мокром помоле и ультразвуковой обработки. Эти методы являются эффективными для производства антиретровирусных наночастиц.

Мокрая мельница и гомогенизация используются для фракционирования крупных частиц кристаллов лекарственного вещества в более мелкие наночастицы в присутствии липидных сурфактантов, а метод соникации позволяет создавать отдельные нанокапли лекарства внутри полимера. В данной работе мы также продемонстрировали использование макрофагов, полученных из моноцитов человека, в качестве тестовой платформы для оценки транспорта наночастиц. Наш метод тестирования позволяет проводить простой скрининг способности частиц поглощаться, удерживаться и высвобождаться клетками, а также их способности подавлять репликацию вирусов.

Это позволяет исследователю определить варианты наноарта, которые имеют наибольшие шансы на успех in vivo и, в конечном итоге, на применение у людей с инфекцией. Полные результаты этих экспериментов опубликованы в нашей статье Online Nano. Статья под названием «Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics» вышла в журнале Journal of Neuro Immune Pharmacology в 2010 году.

Большое спасибо.