Определение воздействия на Мутации BRCA1 гомологичной рекомбинации с использованием клеток, которые экспрессируют эндогенного дикого типа BRCA1

Общая цель следующего эксперимента заключается в тестировании специфических вариантов белка BRCA1 с использованием анализа гомологичной рекомбинации in vitro. Это достигается путем замены эндогенного белка BRCA1 дикого типа тестируемым вариантом посредством трансфекции как малой интерферирующей РНК, специфичной для BRCA1, так и плазмиды для реэкспрессии тестируемых вариантов белка BRCA1 в клетках; на втором этапе малая интерферирующая РНК и плазмида для экспрессии мутантного BRCA1 вводятся вместе с плазмидой для экспрессии белка I-SceI, который вызывает повреждение ДНК в специфическом сайте генома ДНК тестируемой клетки. Затем клетки инкубируют в течение двух-трех дней, чтобы обеспечить возникновение повреждений и последующее восстановление ДНК. В результате проводится анализ методом проточной цитометрии GFP-экспрессирующих клеток, который позволяет определить, функционируют ли специфические варианты белка BRCA1 в процессе репарации ДНК посредством гомологичной рекомбинации.

Данный метод объединяет два общепринятых подхода для создания универсальной системы анализа специфических вариантов белков, участвующих в репарации повреждений ДНК путем гомологичной рекомбинации. Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими является то, что предыдущие методы опирались на клеточные линии с генетическим нокаутом BRCA1. Мы используем более удобную клеточную линию, производную от клеток HELOC, которая позволяет осуществлять делецию BRCA1 путем РНК-интерференции эндогенного белка с последующим введением тестового белка в эти клетки.

Теперь, экспрессируя вариант белка BRC one, мы можем провести тест на гомологичную рекомбинацию. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за чрезмерной гибели клеток в ходе процедуры. Важно тщательно подобрать условия трансфекции, чтобы максимально усилить реакцию рекомбинации, ограничив при этом цитотоксичность.

Перед началом данного протокола клеточная линия HeLa DR 13 была создана путем трансфекции клеток HeLa плазмидой P-D-R-G-F-P. Линию клеток поддерживали в чашках Петри диаметром 10 сантиметров с добавлением пуромицина для селекции стабильно трансфицированных клеток. Рекомбинационный субстрат в плазмиде P-D-R-G-P и в стабильных трансформантах содержит два неактивных аллеля GFP. Один аллель неактивен из-за включения сайта узнавания рестрикционного фермента IseI длиной 18 пар оснований.

В своей кодирующей последовательности экспрессия ISCE one в этих клетках создает двухцепочечный разрыв ДНК или DSB на втором аллеле неактивного GFP. Участок его последовательности, соответствующий сайту I SCE E one на первом аллеле, является диким типом. Этот второй аллель GFP может функционировать как донор последовательности для гомологичной рекомбинационной репарации DSB, что приведет к образованию активного аллеля GFP, который легко детектируется методом проточной цитометрии за день до первой трансфекции.

Возьмите 10-сантиметровую чашку с клетками HeLa DR 13, достигшими конфлюэнтности не менее 90%. Обработайте клетки трипсином в объеме 1 мл в течение двух-трех минут. Остановите реакцию, добавив 9 мл DMEM-FBS, и тщательно перемешайте клеточную суспензию путем пипетирования. Перенесите по 40 мкл трипсинизированных клеток в каждую лунку 24-луночного планшета в 0,5 мл DMEM-FBS. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи.

В первый день конфлюэнтность клеток должна составлять от 40 до 50%. Начните трансфекцию, смешав irna для истощения эндогенного b RCA one и плазмиду, экспрессирующую мутант B RCA one, в среде optimum.

Проведите трансфекцию липектомией в соответствии с инструкциями производителя после осуществления трансфекции. Поместите клетки обратно в инкубатор. Через четыре-шесть часов замените среду на среду, не содержащую антибиотиков.

Верните клетки на инкубацию на ночь во второй день. Для трипсинизации клеток добавьте по 0,3 мл реагента трипсина в каждую лунку; после кратковременной инкубации при 37 °C отделите клетки, аккуратно перемещая их вверх и вниз с помощью пипетки в реагенте с трипсином. После завершения действия трипсина перенесите клетки из 24-луночного планшета в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл DMEM-FBS, чтобы остановить активность трипсина.

Инкубируйте шестилуночный планшет в течение ночи при тех же условиях, что и ранее, через два дня после первоначальной трансфекции. Приготовьте SIR A, плазмидную ДНК, экспрессирующую мутант BRCA1, и экспрессирующую плазмиду ISCE1 в 62,5 µL Optum. Смешайте этот раствор с 2,5 µL LIPECTOMY 2060 и 2,5 µL Optum.

Приступайте к трансфекции клеток после инкубации в течение от четырех до шести часов. Замените среду на D-M-E-M-F-P-S без антибиотиков. Верните клетки в инкубатор на шестой день.

Трипсинизируйте клетки в каждой лунке, добавив 0,5 миллилитра реагента трипсина. Остановите реакцию, добавив два миллилитра D-M-E-M-F-B-S. Соберите клетки путем центрифугирования при 1000 RPM в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре свежего D-M-E-M-F-B-S. Проанализируйте 10 000 клеток на лунку на экспрессию GFP.

С помощью проточной цитометрии проводится гейтирование одиночных живых клеток с использованием параметров прямого и бокового светорассеяния. GFP-положительные клетки выделяются с помощью детектора флуоресценции GFP, и результаты представляются в виде гистограммы. Остальные клетки можно перенести на новые планшеты для проведения флуоресцентной микрофотографии.

Микроскопия показала, что белок BRCA1 регулирует путь репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством гомологичной рекомбинации. Клетки, в которых прошла репарация путем гомологичной рекомбинации, легко обнаруживаются с помощью флуоресцентной микроскопии. Истощение уровня BRCA1 с помощью РНКи приводит к резкому снижению количества обнаруженных GFP-положительных клеток.

Результатом FCA является гистограмма, где по оси X отложена интенсивность GFP на одну клетку, а по оси Y — количество клеток. В отсутствие трансфекции плазмидой экспрессии в SCE один GFP-положительные клетки не обнаруживаются.

Результаты во втором–шестом столбцах были получены из клеток, в которые на третий день была трансфицирована плазмида, экспрессирующая I SCE one. В типичном наборе результатов одного эксперимента 15,5% клеток становятся GFP-положительными после экспрессии I SCE one и контрольного РНК-интерференционного истощения нерелевантного гена; для сравнения, истощение BRCA one и добавление пустого плазмидного вектора снижают уровень конверсии GFP до 0,7%. Добавление экзогенного BRCA one дикого типа полностью восстановило гомологичную рекомбинацию, что подтверждается получением 15–16% GFP-положительных клеток.

Аналогичным образом, экспрессия другого варианта с неопределенным значением. Мутация BRCA1 21B полностью восстановила функцию гомологичной рекомбинации, зависимую от BRCA1; введение мутанта BRCA1 M18T оказало эффект, аналогичный контрольному вектору.

Поскольку данный вариант экспрессировался на уровне, близком к уровню эндогенного белка, это позволяет предположить, что вариант BRCA1 M18T нефункционален в процессе гомологичной рекомбинации. При выполнении данной процедуры важно контролировать рост клеток, учитывая, что они растут медленно и при низкой конфлюэнтности, в связи с чем необходимо уменьшить объем используемой смеси для трансфекции. Также важно своевременно удалить трансфекционную среду.

Мы обнаружили, что в дни после трансфекции наблюдается высокая степень цитотоксичности, если в среду добавлены антибиотики. По этой причине во всей среде после первого дня культивирования антибиотики отсутствуют. Данный метод открыл исследователям в области рака молочной железы возможность изучать генетику вариантов BRC 1 с неизвестным клиническим значением в онкологических клиниках.

Мы надеемся, что разработанный в данной работе функциональный анализ BRC one позволит улучшить прогнозирование влияния вариантов BRC one на предрасположенность к раку.