Очищающий плазмидной ДНК из бактериальных колоний Использование Qiagen Miniprep Kit

Я из лаборатории Майка Хейлена кафедры физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как использовать колонки для мини-препарирования коллагена для очистки ДНК из бактерий. Я выполняю это как один из этапов эксперимента по сайт-направленному мутагенезу.

После получения плазмиды я проведу секвенирование вставки, чтобы убедиться, что выбранные клоны содержат необходимые мутации. Прежде чем приступить к мини-препарации, кратко опишу действия, выполненные вчера. Для выращивания бактерий мне сначала необходимо инокулировать 5 мл среды LB в отдельные пробирки.

Как видите, до внесения бактерий в пробирку среда прозрачна. Затем с помощью дозатора я переношу одну колонию с чашки Петри, каждый раз меняя наконечник, чтобы избежать контаминации. После этого я помещаю пробирки в шейкер, где при 300 RPM они инкубируются в течение как минимум восьми часов; обычно этот процесс проводят в течение ночи.

В наборе для мини-выделения коллагена используются три важных буфера: P1, P2 и N3. Обычно мы храним P1 при температуре 4 °C, так как он содержит РНК, P2 оставляем при комнатной температуре, а буфер N3 подготавливаем непосредственно перед началом эксперимента, выдержав его в течение 8 часов.

Как видно, среда стала мутной из-за роста бактерий; я перенесу 5 µL среды на другую чашку. Таким образом, после проверки клонов я смогу вернуться непосредственно к бактериям, и мне не потребуется проводить повторную трансформацию. После центрифугирования среды на дне пробирки виден четкий бактериальный осадок; мы удалим супернатант в раствор гипохлорита натрия, чтобы избежать загрязнения окружающей среды, при этом осадок останется на месте.

Теперь я добавляю буфер P1 к бактериальным пеллетам. Буфер P1 представляет собой буфер для ресуспендирования бактерий. Теперь я буду перемещать раствор дозатором вверх и вниз, чтобы перемешать бактерии с буфером.

На данном этапе в растворе не должно быть никаких бактериальных хлопьев. Теперь я перенесу ресуспендированные бактерии в новую пробирку Eppendorf. Я всегда маркирую свои пробирки, чтобы иметь возможность отслеживать их и знать, из какого клона получен тот или иной раствор.

Теперь я добавляю буфер P2 в каждую пробирку; буфер P2 представляет собой лизирующий буфер для лизиса бактерий. После добавления буфера P2 видно, что раствор все еще не прозрачный. Теперь я несколько раз переворачиваю все пробирки, чтобы раствор хорошо перемешался.

Теперь видно, что раствор становится прозрачным. Сейчас я добавлю буфер N3; в каждую пробирку добавляется буфер M3, который является нейтрализующим буфером. Сразу после добавления буфера N3 я наблюдаю преципитацию белка, но тем не менее я несколько раз переверну пробирки, чтобы тщательно перемешать раствор.

После тщательного перемешивания раствора. Вот так должен выглядеть образец после добавления буфера 3. Теперь я воспользуюсь центрифугой для осаждения белка; центрифугирование будет проводиться в течение 10 минут. Я подготовил Cal VAC 6 s.

Я собираю все детали в правильном порядке, после чего подключаю их к вакуумной системе. Теперь я закрепляю вспомогательное устройство для подготовки калибровки, прикрепив ремень к коллектору. Сегодня мы подготовим только один образец, поэтому я перекрываю остальные слоты.

Таким образом, мы создали хороший вакуум. Как видите, я промаркировал крепление в соответствии с моими пробирками, и после включения вакуумного насоса установился необходимый вакуум. Хорошо, после центрифугирования пробирки видно, что белковый осадок находится на дне, а ДНК по-прежнему растворена в супернатанте.

Теперь мы переносим супернатант, содержащий ДНК, на стрипы для подготовки КОВ (cow prep). Следует отметить, что нам всегда необходимо менять наконечники, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Теперь я включаю вакуум. Теперь я выключаю вакуум и добавляю буфер PB для промывки стрипа, в фильтре которого в данный момент находится ДНК.

Теперь я добавляю раствор PB на полоску для ее промывки; при этом ДНК остается в фильтре полоски. В этот раз мне не нужно менять наконечники, если я не касаюсь полоски. Теперь я добавляю буфер P на полоску таким же образом, как это было сделано с буфером PB.

Я повторю это действие дважды после включения вакуума. Как видите, в данный момент раствор P проходит через полоску; мы оставим вакуум включенным еще на пять минут, чтобы фильтр полностью высох. По истечении пяти минут вакуумирования извлеките полоску из бокса и оберните ее салфеткой Kimwipe. Слегка постучите полоской по столу, чтобы удалить остатки буфера P.

Теперь видно, что осталось совсем немного буфера P, и ДНК всё еще должна находиться в фильтре. Перед нами пробирки для сбора. Я промаркировал их в соответствии с полосками.

Теперь я открываю вакуумный установку и собираю ее вместе со сборными микропробирками, проверяя, чтобы полоски соответствовали микропробиркам. Вот как должен выглядеть коллектор в данный момент. Перед вами вакуумный коллектор, подготовленный для элюирования ДНК с полоски в микропробирку.

Полоска находится сверху, а пробирка — непосредственно под ней, и они промаркированы одинаково. Теперь добавьте стерильную воду на полоску без создания вакуума и оставьте на одну минуту. В этот раз при длительном воздействии вакуума, как видно, вода проходит через полоску и попадает в собирающие микропробирки.

Вода содержит ДНК. Я также оставляю вакуум включенным на некоторое время, чтобы убедиться, что вся вода будет собрана. Перед вами микроцентрифужные пробирки с раствором ДНК после завершения данного этапа.

Здравствуйте! Я только что продемонстрировал вам, как использовать набор для мини-препарации ДНК с помощью хлорида кальция для очистки ДНК из бактерий. Теперь я проведу секвенирование вставки, чтобы подтвердить правильность клонов, и мне следует упомянуть об использовании этого метода. Выход ДНК обычно составляет около микрограммового уровня.

Желаем успехов в ваших экспериментах. Спасибо за просмотр.