Биоэнергетический Эксперимент профиля использования C2C12 клетках миобластов

Общая цель следующего эксперимента заключается в проверке функционального состояния митохондрий в живых клетках и изолированных митохондриях путем измерения нескольких параметров окислительного метаболизма с помощью анализатора внеклеточного потока XF 96. Этими параметрами являются базальное дыхание, оборот ATP, утечка протонов, а также максимальное дыхание или резервная дыхательная способность. Это достигается путем последовательного добавления специфических модуляторов митохондриального дыхания к клеткам миобластов C2C12 и измерения изменения скорости потребления кислорода (OCR), которая служит индикатором дыхания, а также конверсии глюкозы в лактат, в результате которой ATP вырабатывается путем гликолиза.

Другим основным путем потребления энергии в клетках является ECAR или скорость внеклеточного закисления. Результаты митохондриального профилирования позволяют понять центральную роль, которую функция митохондрий играет в определении продолжительности жизни клеток. Здравствуйте, меня зовут Дэвид Николс.

На протяжении всей своей карьеры я занимался изучением митохондрий, и самым важным оборудованием в моих исследованиях был кислородный электрод. Измерение скорости потребления кислорода изолированными митохондриями в различных условиях позволяет получить колоссальный объем важной информации. Однако при переходе к клеткам, особенно к тем, которые культивируются в многолуночных планшетах или на покровных стеклах, классические методы оказываются неэффективными.

Это серьезная проблема, которая была решена несколько лет назад благодаря разработке метода анализа в многолуночных планшетах, что позволило нам изучать дыхание клеток параллельно в формате многолуночного планшета. Сегодня вы увидите очень простой, но информативный эксперимент, который мы разработали для мониторинга базовой митохондриальной биоэнергетической функции в культивируемых клетках. Для начала посейте клетки в культуральные планшеты XF 96 из расчета 10 000 клеток на лунку в 100 µL ростовой среды и поместите их в инкубатор при 37 °C с 10% CO2.

Клетки можно проанализировать в XF 96 через 24 часа после посева с помощью данного метода. Мастер (Wizard) создает шаблон со следующим расположением групп. Столбцы с 1-го по 12-й содержат по 10 000 клеток C two C 12.

Группа один, отмеченная синим цветом, используется в качестве контрольных клеток. Группе два, отмеченной красным цветом, будут введены препараты олигомицин, FCCP и роотеннон. Далее приготовьте соединения в assay-среде X-F-D-M-E-M, как описано в текстовой части протокола.

Олигомицин, FCCP, ротенон. Эти соединения предварительно дозированы в наборе для XF-теста на митохондриальный стресс. С помощью станции подготовки XF замените ростовую среду на рабочую среду DMEM.

Наконец, инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 °C без углекислого газа в течение 60 минут, чтобы клетки предварительно уравновесились с assay Medium перед добавлением в картридж датчика инъекционных соединений; доведите соединения до 37 °C. Затем загрузите их в инъекционные порты следующим образом. Для колонок с первой по четвертую загрузите 16, 18 и 20 µL XF assay medium или DMEM в порты A, B и C соответственно.

Для колонок с пятой по двенадцатую внесите 16 µL аллигамицина в порт A, 18 µL FCCP в порт B и 20 µL ротенона в порт C. Затем определите протокол: установите количество циклов (loop) на три, время перемешивания (mix) — на три минуты и время измерения (measure) — на три минуты. После этого нажмите кнопку «Пуск» (start).

Следуйте инструкциям на экране, которые укажут пользователю, когда следует загрузить картридж по завершении калибровки. Следуя подсказкам системы, установите планшет с клетками для эксперимента. Затем нажмите «Продолжить» (continue) и запустите анализ.

Извлеките планшет по завершении эксперимента. Данный анализ основан на классическом эксперименте по профилированию митохондриальной функции и служит базой для разработки более сложных экспериментов, направленных на изучение влияния различных соединений на метаболизм клеток, функцию митохондрий и общую биоэнергетическую активность. В данном случае мы наблюдали ожидаемый ответ скорости потребления кислорода при последовательном воздействии на клетки каждым из соединений.

В результате воздействия лигамицина уровень ATP снизился из-за блокирования синтеза ATP в пятом митохондриальном комплексе. Поскольку после обработки лигамицином клетки не могли синтезировать ATP посредством окислительного фосфорилирования, они перешли на гликолиз для удовлетворения потребности в ATP. Таким образом, мы наблюдали увеличение ECAR (скорости внеклеточного закисления), которая, как было показано ранее, является индикатором гликолиза. FCCP действует как разъединяющий агент и устраняет ограничение на обратный ток протонов.

Дыхание ускоряется и теперь лимитируется транспортом электронов. Наконец, ротенон ингибирует комплекс I митохондрий, что приводит к прекращению потока электронов в цепи переноса электронов, вследствие чего потребление кислорода резко снижается. Таким образом, полученные данные позволяют определить уровень базального дыхания клеток, процент потребления кислорода, затрачиваемый на синтез АТФ, а также долю, идущую на поддержание протонного градиента из-за утечки протонов.

Кроме того, мы можем получить максимальную скорость дыхания в условиях разобщенного дыхания, что иногда называют резервной дыхательной способностью. И, наконец, мы можем определить количество потребления кислорода, не связанное с митохондриальными процессами. Вы только что увидели это с помощью системы Seahorse.

XF 96 — это серия экспериментов, позволяющая получить огромный объем данных об энергетике биоинтеграции (BIE) митохондрий в клетке. Базовый эксперимент, имеющий ключевое значение и называемый экспериментом № 1, предоставляет информацию о базальном дыхании, обороте АТФ, утечке протонов из митохондрий и резервной дыхательной способности. Эти параметры дают фундаментальное представление о биоэнергетическом статусе митохондрий в клетке.