Аналитический инструмент коробки комплексных биохимические, структурные и транскриптома Оценка устного Биопленки посредничестве Mutans стрептококков

Биопленки, образующиеся на поверхности зубов, очень сложны и структурированы. Микробные сообщества, оплетенные во внеклеточный матрикс, подвергаются постоянным вызовам окружающей среды. Общая цель здесь состоит в том, чтобы показать два конкретных компонента аналитического инструментария, разработанного для облегчения структурных и молекулярных исследований, учитывая сложную природу биопленок полости рта, путем сочетания нового метода флуоресцентной визуализации с специально разработанным программным обеспечением для обработки и анализа данных.

Это достигается путем предварительного выбора конкретных анализов для анализа биопленки, транскриптома и структуры, включая новый подход к конфокальной визуализации для одновременной визуализации ЭПС и бактерий. Вторым этапом процедуры является сбор исходных данных биотестов. Третий шаг заключается в обработке исходных данных с помощью специального программного обеспечения, в том числе недавно разработанного duo stat для анализа колокализации.

Заключительным этапом является анализ технологических данных, включая использование микрочипов и программного обеспечения для организации микрочипов, визуализатора данных или MDV. В конечном счете, можно получить результаты, показывающие, как патогены полости рта изменяют свой транскриптом и архитектуру биопленок в ответ на сложные взаимодействия микроорганизмов с питанием и хозяином, используя наш уникальный интегрированный аналитический инструментарий, обеспечивающий более полный анализ биопленки и интерпретацию данных. Здравствуйте, меня зовут Мишель Ку, я доцент центра биологии Форал здесь, в Universal Медицинского центра Рочестера.

Сегодня мы представляем аналитический инструментарий для анализа биопленки. Этот инструментарий может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования биопленки, такие как структура клеток биопленки, их расположение с внеклеточным матриксом и их реакция на сложные вызовы окружающей среды на транскриптомном уровне. Меня зовут Джин, она, я постдок в лаборатории доктора Кс.

Сегодня я собираюсь продемонстрировать часть нашего набора инструментов, связанную с визуализацией. Привет, меня зовут Айз Кляйн. Я являюсь научным сотрудником, доцентом в лаборатории доктора Кс.

Сегодня я представлю программное обеспечение MDV для анализа микрорентгеновских данных. В этой процедуре гидроксидиски аппетита, покрытые слюной, используются в качестве суррогатов поверхности зубов, на которые выращиваются биопленки. Сначала добавьте 2,8 миллилитров питательной среды, инокулированной S-мутантами, в каждую лунку 24-луночного планшета, защищающего планшет от света на конъюгированном декстрином красителе LOR 6 47 в каждую лунку до конечной концентрации одного микромоля, и пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать краситель с питательной средой.

Затем с помощью стерильных щипцов окуните стерильные диски, покрытые слюной, дважды в стерильном буфере AB, чтобы удалить избыток слюны или несвязанные компоненты слюны. Затем поместите диски вертикально в питательную среду с добавлением красителя, следя за тем, чтобы каждый диск был полностью погружен в воду. Накройте пластину алюминиевой фольгой и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение 20 часов, чтобы дать возможность образоваться биопленкам и включить сопряженную текстуру в экзополисахариды, производимые бактериальными клетками.

Чтобы сначала пометить бактериальные клетки, приготовьте планшет на 24 лунки с 2,8 миллилитрами стерильной воды milli Q на лунку. Добавьте по 1,5 микролитра красителя cyto nine в каждую лунку до конечной концентрации в один микромоляр и защитите пластину от света. Как только биопленка сформируется, извлеките пластину с дисками из погружного инкубатора.

Промойте каждый диск в растворе 0,89% хлорида натрия. Затем перенесите их на новую пластину, содержащую краситель cyto nine. Накройте тарелку алюминиевой фольгой и выдержите ее в течение 30 минут при комнатной температуре.

После того, как клетки были окрашены, окунитесь в воду, промойте биопленки и хлорид натрия, как и раньше. Затем с помощью щипцов выпустите биопленки из проволоки в чашку Петри, содержащую хлорид натрия. Оберните чашку Петри алюминиевой фольгой.

В настоящее время биопленки готовы к визуализации с помощью конфокальной микроскопии с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Отсканируйте каждую биопленку в 5-10 случайно выбранных позициях и сгенерируйте серию Z в каждой позиции. Чтобы сделать 3D-реконструкцию, откройте конфокальные изображения и обработайте их с помощью зеркального программного обеспечения.

Эта трехмерная визуализация конфокальных изображений, полученных с помощью программы, показывает биопленку S-мутантов, сформированную на апатичной поверхности с использованием продемонстрированной процедуры. Бактериальные клетки и микроколонии видны зеленым цветом и встроены в биопленочную матрицу, содержащую экзополисахариды. Красным цветом может быть сгенерирован крупный план выбранной области, который иллюстрирует структурные отношения конкретных бактерий EPS в микромасштабе.

Используйте программу duos stat для количественной оценки количества колокализации отдельных компонентов биопленки, таких как бактерии и экзополисахариды. Сначала настройте путь к недавно разработанному duo stat в MATLAB версии 5.1 и откройте папки с изображениями, содержащие изображения двух компонентов биопленки серии Z. Далее выберите два канала, которые будут соотнесены и проанализированы.

Два стека изображений должны иметь одинаковые размеры в пикселях во всех измерениях и одинаковое количество изображений в каждом стеке. Установите пороговые значения для каждого канала и следуйте инструкциям в интерфейсе программного обеспечения и введите данные в файл обработки данных для анализа. На этом рисунке показано, как duo stack количественно интерпретирует пространственные отношения между бактериями и DBS.

В биопленке Duo stack рассчитывает вертикальное распределение бактерий и DPS от поверхности диска до жидкой фазы, как показано на зеленой линии для бактерий и красной линии для EPS. Он также рассчитывает колокализацию бактерий и DPS по толщине биопленки. Как показано на желтой линии, данные показывают более высокую долю ЭПС, чем бактерий по всей глубине биопленки, и большинство бактериальных клеток связаны с ЭПС, особенно от средних слоев и выше.

Для того, чтобы обеспечить получение высококачественной РНК из биопленок, мы рекомендуем проводить экстракцию РНК в соответствии с протоколом, специфичным для биопленки, описанным в статье Curian KU, опубликованной в 2007 году. В журнале используются стандартные протоколы аналитической биохимии для подготовки микрочипов CD NA и количественных ПЦР-анализов в реальном времени. Чтобы облегчить анализ больших наборов данных, полученных в результате экспериментов с микрочипами, мы разработали программное обеспечение для интеллектуального анализа данных и организации — визуализатор данных микрочипов или MDV, которое доступно в Интернете по адресу www.oralgen.anl.gov.

Перед отправкой данных в MDV проведите статистический анализ, такой как парный T-критерий с моделью случайной дисперсии, используя программное обеспечение BRB array, доступное в Интернете, со значением P 0,001 для сравнения классов. В этом примере был проведен анализ баранины, биопленки, выращенные в трех различных концентрациях сахара и четырех временных точках. Парные сравнения были проведены при условии получения трех файлов BRB: 0,5% сахарозы плюс 1% крахмала против 1% сахарозы, состояние В, 0,5% сахароза плюс 1% крахмала против 0,5% сахарозы и условие С: 0,5% сахарозы против 1% сахарозы.

На этой панели представлено количество генов, обнаруженных как дифференциально экспрессирующиеся в каждом состоянии и временной точке, оцененные путем стандартного сравнения классов с использованием инструмента BRB array, что приводит к получению большого количества генов, названных необработанными данными BRB. Для демонстрации MDV мы сосредоточимся на временной точке 30 часов с использованием Excel. Конвертируйте необработанные данные BRB в текстовые файлы с ограничением вкладки MDV.

Обязательно удалите все буквы, которые идут с номером вкладки локуса гена, например в названии SMU dot 1432 C. Удалите букву C, откройте MDV. Откройте меню «Файл» и выберите «Выбрать источник аннотации». Выберите опцию «Неструктурированный файл», когда появится диалоговое окно.

Используйте кнопки обзора для выбора файлов, содержащих аннотации для онтологии генов, номеров, путей, функциональной классификации, данных и имени гена. Перейдите в раздел «Файл» и импортируйте каждый из файлов, преобразованных в формат MDV. Каждый файл представляет собой экспериментальное условие.

Сравните гены, экспрессируемые в каждом экспериментальном условии А, В и C.In этом примере, используя функцию диаграммы Венна. Для этой демонстрации мы сосредоточились на дифференциально экспрессируемых генах, которые однозначно связаны с влиянием сахарозы и крахмала в комбинации. Функция на основе диаграммы Венна используется для визуализации количества уникальных и общих генов, экспрессируемых в этих различных условиях, и помогает нам определить те, которые должны быть выбраны для дальнейшего анализа.

Здесь мы выбираем только дифференциально экспрессируемые гены, уникальные в состоянии А и/или В, но не те, которые обнаруживаются в С, как показано серым цветом, как показано здесь. MDV значительно сократил общее количество анализируемых генов и в то же время отфильтровал нерелевантные для экспериментального случая гены. В меню «Файл» выберите опцию экспорта, чтобы сохранить данные.

В виде файлов с ограниченным вкладкой файлы затем могут быть открыты в Excel, где выходные данные могут быть организованы и преобразованы в желаемые графические отображения. Организация данных в Excel позволяет графически отображать выходные данные MDV. На этом графике представлен обзор дифференциальной экспрессии уникальных функциональных подмножеств генов, на которые влияет комбинация крахмала и сахарозы на различных стадиях развития биопленки.

Влияние на транскриптом S-мутантов более выражено через 30 часов развития биопленки, чем в другие временные точки. Полученные результаты помогли нам точно определить конкретные функциональные подмножества генов, которые имеют отношение к нашей рабочей гипотезе, учитывая временные эффекты, которые способствовали отбору генов и дальнейшему процессу валидации. После этой процедуры также могут быть выполнены биохимические и протеомные методы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каковы специфические физиологические и метаболические реакции организмов в биопленках.

Такой всесторонний и интегрированный анализ, безусловно, поможет лучше понять, как биопленки модулируют патогенность в полости внутри помещений, высокодинамичной и сложной среде. Для получения более подробной информации, пожалуйста, ознакомьтесь с PDF-файлом, приложенным к этой видеостатье.