Выделение мышью Респираторные эпителиальных клеток и воздействие экспериментальный сигаретный дым в воздухе жидкость

Общая цель данной процедуры заключается в выделении эпителиальных клеток дыхательных путей для изучения токсического воздействия сигаретного дыма. Это достигается путем предварительного препарирования трахей мышей с последующим перевариванием трахеи в растворе проназы. Вторым этапом процедуры является сбор эпителиальных клеток и размножение полученной культуры.

Третьим этапом является дифференцировка культур на границе раздела фаз «воздух-жидкость». Заключительный этап процедуры заключается в воздействии сигаретного дыма на апикальную поверхность эпителиальных клеток на границе раздела «воздух-жидкость». В итоге методом иммунофлуоресцентной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие полностью дифференцированный монослой эпителиальных клеток.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области изучения хронической обструктивной болезни легких, такие как влияние воздействия сигаретного дыма на морфологию CLIA и индуцированные сигаретным дымом биохимические маркеры повреждения клеток. Начните подготовку к данной процедуре за один день до препарирования, приготовив среду Ham's F 12 с антибиотиками, среду Ham's F 12 с антибиотиками и 20% F-B-S-M-T-E-C, а также базовую среду с антибиотиками.

Приготовьте среду для MTEC с 5% FBS, стоковые растворы ретиноевой кислоты из набора DNA's one solution и пролиферационную среду для MTEC в соответствии с инструкциями, изложенными в письменном протоколе. В день проведения процедуры стерилизуйте все хирургические инструменты, которые будут использоваться при диссекции. Убедитесь, что рабочая зона чиста и все инструменты для диссекции находятся под рукой.

Стерилизуйте ламинарный шкаф для культур тканей. Затем, работая в ламинарном шкафу, приготовьте 0,15% раствор проназы.

Добавьте 15 milligrams проназы в 10 milliliters среды hams. F 12 с антибиотиками в коническую пробирку объемом 50 milliliter. Храните на льду до использования.

Трахеи мышей выделяют с помощью стандартных хирургических процедуй; продезинфицируйте пробирку с трахеями и поместите ее в ламинарный шкаф для культивирования тканей. Перенесите ткань трахеи в чашку Петри диаметром 100 мм со средой Ham's F 12, содержащей антибиотики. С помощью стерильного хирургического пинцета удалите соединительную ткань из трахей.

Затем перенесите очищенные трахеи во вторую чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую среду Ham's F 12 с антибиотиками. С помощью диссекционных ножниц разрежьте трахеи вдоль вертикальной оси, чтобы открыть просвет.

Перенесите трахеи в коническую пробирку объемом 50 milliliter, содержащую 10 milliliters раствора Pronase, и поместите в холодильник для инкубации в течение ночи при температуре четыре degrees Celsius. В завершение подготовьте трансвелл-планшеты, обработанные коллагеном one, для дальнейшего использования. На следующий день добавьте 50 milligrams коллагена one на каждый milliliter 0,02 N уксусной кислоты; с помощью пипетки внесите один milliliter этого раствора в каждую лунку 12-луночного планшета.

Промойте планшет для микротитрования. Оберните планшет парафильмом и оставьте на ночь при комнатной температуре в ламинарном шкафу для культур тканей. На следующий день.

Осторожно переверните пробирку с трахеями мышей 10–12 раз. Затем инкубируйте содержимое пробирки еще 30–60 минут при температуре four degrees Celsius. Работая в ламинарном шкафу для культур тканей, перенесите пипеткой 10 milliliters среды hams F 12 с антибиотиками и 20%FBS в коническую пробирку с переваренной тканью трахеи и переверните ее 12 раз.

Затем дозированно внесите по 10 milliliters среды hams F 12 с антибиотиками и 20%FBS в каждую из трех конических пробирок объемом 15 milliliter. С помощью стерильной пастеровской пипетки перенесите ткань трахеи из раствора проназы в первую из пробирок, содержащих дополненную среду hams. F 12.

Поместите раствор Pronase на лед, закройте крышкой пробирку с трахеальной тканью и осторожно переверните ее 12 раз для перемешивания. Затем с помощью пастерной пипетки перенесите трахеальную ткань во вторую коническую пробирку объемом 15 мл и переверните эту пробирку 12 раз. Повторите процедуру переноса и перемешивания с последней конической пробиркой объемом 15 мл.

Наконец, с помощью пастеровской пипетки удалите и утилизируйте ткани трахеи. Затем достаньте раствор проназы со льда и объедините три объема по 15 мл дополненной среды Ham's F 12 с раствором проназы. Центрифугируйте образец в охлажденной центрифуге при 4 °C в течение 10 минут при 1 400 об/мин. После центрифугирования удалите супернатант, затем нанесите пипеткой примерно 100–200 µL раствора DNAse I на осадок и ресуспендируйте.

Ресуспендируйте содержимое путем осторожного постукивания. Инкубируйте клетки на льду в течение пяти минут. Центрифугируйте пробирку при 1 400 об/мин в течение пяти минут при температуре 4 °C и удалите супернатант.

Затем пипетируйте восемь миллилитров среды MTEC, содержащей 10% FBS, на осадок и ресуспендируйте содержимое планшета. Суспензию клеток в планшете paria инкубируют при 37 °C в атмосфере с 95% воздуха и 5% углекислого газа в течение пяти-шести часов. Данный этап представляет собой отрицательную селекцию для удаления фибробластов.

После инкубации соберите клеточную суспензию с чашки Петри и перенесите ее пипеткой в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем дважды промойте чашку четырьмя миллилитрами среды MTEC, содержащей 10% FBS. Перенесите обе порции промывочной жидкости в коническую пробирку объемом 50 мл с клеточной суспензией.

Пипеткой перенесите 1 мл клеточной суспензии в пробирку типа Эппендорф. Сохраните эту аликвоту для анализа с помощью цитоцентрифуги и подсчета клеток. Коническую пробирку объемом 50 мл с оставшимися 15 мл клеточной суспензии центрифугируют при 1 400 об/мин при температуре 4 °C в течение 10 минут.

Во время центрифугирования удалите и утилизируйте раствор коллагена из предварительно подготовленного планшета с трансвеллами. Оставьте планшет просохнуть под вытяжным шкафом в течение пяти минут, затем дважды промойте его раствором PBS, после чего выполните финальную промывку. Аспирируйте весь PBS и после центрифугирования внесите 1.5 milliliters среды для пролиферации в базальный отсек трансвелла с помощью пипетки.

Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в соответствующем объеме пролиферационной среды, чтобы обеспечить посев от 7,5 × 10⁴ до 1 × 10⁵ клеток в 500 µL суспензии на лунку. Пипетируйте 500 µL клеточной суспензии на апикальную поверхность поликарбонатной мембраны вставки Transwell. Инкубируйте погруженные культуры MTEC при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 95% воздуха и 5% carbon dioxide в течение 7–10 дней, меняя среду через день.

Измерьте трансэпителиальное электрическое сопротивление с помощью интервалометра. Когда сопротивление эпителия достигнет 1000 ohms/cm² и культуры станут конфлюэнтными, переведите их в режим культуры с жидкостным интерфейсом (LI), удалив апикальную среду.

Также замените базальную среду на базовую среду MTEC, содержащую 2% новой сыворотки и ретиноевую кислоту. Инкубируйте культуры при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение 10–14 дней для дифференцировки, заменяя среду через день. Сначала настройте курительную машину в соответствии с инструкциями производителя.

Запишите вес неиспользованного фильтра Pole Flex. Затем поместите фильтр в линейный держатель из нержавеющей стали на пробном трубке, ведущей от порта отбора проб в камере для курения к насосу с постоянным потоком. Подключите блок отбора проб к газовому счетчику с помощью выходной трубки, используя систему экспозиции ячеек CS.

Подвергните апикальную сторону культур Transwell воздействию основного потока сигаретного дыма от трех исследовательских референсных сигарет R4F. Воздействуйте на клетки дымом от одной-двух сигарет. Контрольные культуры подвергните воздействию комнатного воздуха в течение эквивалентного периода времени после отбора проб газа для определения массы.

Для гибкого фильтра (pool flex filter) нормализуется общая масса материала, осажденного на фильтре в миллиграммах. При общем объеме отобранного воздуха дым от одной-двух сигарет обычно дает от 100 до 200 мг/м³ общего содержания взвешенных частиц (TPM). После воздействия сигаретного дыма соберите клетки и базальную среду для дальнейшего анализа.

На данном примере представлен здоровый монослой эпителиальных клеток дыхательных путей мыши, окрашенный на ядерные маркеры и маркеры эпителиальных клеток. Успешная изоляция, пролиферация и дифференцировка эпителия характеризуются наличием целостного монослоя с «булыжной» морфологией. Культуры практически не содержат фибробластов.

Данные электронные микрофотографии представляют собой типичные культуры здоровых MTEC и демонстрируют ультраструктуру различных типов клеток и морфологию CELIA. Это видео визуализации живых клеток показывает здоровую морфологию C в культурах MTEC. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как изолировать эпителиальные клетки трахеи мыши, дифференцировать их на границе раздела фаз «воздух-жидкость» и подвергать их воздействию основного потока сигаретного дыма.