Выделение мышью Респираторные эпителиальных клеток и воздействие экспериментальный сигаретный дым в воздухе жидкость

Общая цель этой процедуры заключается в выделении эпителиальных клеток дыхательных путей для изучения токсических эффектов воздействия сигаретного дыма. Это достигается путем сначала рассечения трахеи мыши, а затем расщепления трахеи в растворе проназы. Вторым этапом процедуры является сбор эпителиальных клеток и размножение культуры quid.

Третий шаг заключается в дифференциации культур на границе раздела воздушной жидкости. Заключительным этапом процедуры является воздействие на эпителиальные клетки апикального сигаретного дыма на границе воздушной жидкости. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают полностью дифференцированный монослой эпителиальных клеток с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хронической обструктивной болезни легких, такие как влияние воздействия сигаретного дыма на морфологию CLIA и индуцированные сигаретным дымом биохимические маркеры повреждения клеток. Начните подготовку к этой процедуре за день до вскрытия с подготовки ветчины. F 12 среды, содержащие антибиотики, ветчины F 12 среды, содержащие антибиотики и 20% F-B-S-M-T-E-C, основная среда, содержащая антибиотики.

Среда MTEC с 5% FBS DNA, однорастворительными исходными растворами ретиноевой кислоты и пролиферационной средой MTEC в соответствии с инструкциями в письменном протоколе. Стерилизуйте все хирургические инструменты, которые будут использоваться при вскрытии, в день вскрытия. Убедитесь, что область вскрытия чистая и все инструменты для вскрытия находятся под рукой.

Простерилизуйте вытяжку для культуры тканей. Затем работа в вытяжке для культуры тканей. Приготовьте раствор из 0,15% проназы.

Добавьте 15 миллиграммов проназы на 10 миллилитров ветчины. F 12 среды, содержащие антибиотики, в конической тубе объемом 50 миллилитров. Выложите на лед до использования.

Трахеи мышей препарируют у мышей Используя стандартные хирургические процедуры, дезинфицируют трубку, содержащую трахею, и помещают в капюшон для культуры тканей. Перенесите ткань трахеи в 100-миллиметровую чашку Петри с окороком F 12 среды, содержащей антибиотики. Используйте стерильные хирургические щипцы для удаления соединительной ткани из трахеи.

Затем переложите чистые трахеи во вторую 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую ветчину. F 12 сред с антибиотиками. С помощью ножниц для препарирования разрежьте трахеи по вертикальной оси и обнажите просвет.

Переложите трахеи в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 10 миллилитров раствора проназы, и поместите в холодильник для инкубации в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Наконец, приготовьте коллагеновые обработанные трансвелл пластины для использования. На следующий день добавьте по 50 мг коллагена, по одному на миллилитр 0,02 Н уксусной кислоты пипеткой по одному миллилитру этого раствора в каждую лунку по 12 мг.

Хорошо переведите колодец пластина. Оберните пластину в пара-пленку и дайте постоять ночь при комнатной температуре в вытяжке для культуры тканей. На следующий день.

Аккуратно переверните трубку, содержащую трахеи мыши, от 10 до 12 раз. Затем дайте содержимому пробирки инкубироваться еще от 30 до 60 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Работая в тканевой культуре капюшона пипеткой 10 миллилитров ветчины F12 сред, содержащих антибиотики в 20% FBS, в коническую трубку, содержащую переваренную трахеальную ткань и перевернутую 12 раз.

Затем пипеткой по 10 мл ветчины F 12 среды, содержащей антибиотики в 20% FBS, в каждую из трех 15 миллилитровых конических пробирок. С помощью стерильной пипетки для пасты перенесите ткань трахеи из раствора проназы в первую из пробирок, содержащих добавки с ветчиной. F 12 медиа.

Нанесите раствор проназы на ледяную крышку пробирки, содержащей ткань трахеи, и аккуратно переверните 12 раз для перемешивания. Затем с помощью пипетки для пасты перенесите ткань трахеи во вторую коническую трубку объемом 15 миллилитров и переверните эту трубку 12 раз. Повторите процедуру переноса и инверсии, используя коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Наконец, с помощью пипетки для пасты удалите и выбросьте ткань трахеи. Затем достаньте раствор проназы изо льда и соедините три 15-миллилитровых объема дополненной ветчинной среды F 12 с раствором проназы. Центрифугируйте образец в охлажденной центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут со скоростью 1400 оборотов в минуту после центрифугирования выбросьте супену, затем пипеткой нанесите примерно от 100 до 200 микролитров ДНК, по одному раствору на трахею, на гранулу и реус.

Приостановите с легким постукиванием. Инкубируйте клетки на льду в течение пяти минут. Центрифугируйте пробирку со скоростью 1 400 оборотов в минуту в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия и выбросьте супинат.

Затем нанесите пипеткой восемь миллилитров среды MTEC, содержащей 10% FBS, на гранулу и ресуспендированную пластину. Клеточная суспензия на париевой пластине инкубируется при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа в течение пяти-шести часов. Это негативный этап отбора для удаления фибробластов.

После инкубации соберите клеточную суспензию с париальной пластины и пипеткой в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Затем дважды промойте пластину четырьмя миллилитрами среды MTEC, содержащей 10% FBS. Перенесите обе промывки в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую клеточную суспензию.

Пипеткой введите один миллилитр клеточной суспензии в эйноровую пробирку. Оставьте эту аликвоту для анализа цитоспинового анализа и центрифуги для подсчета клеток. Коническая трубка объемом 50 миллилитров, содержащая оставшиеся 15 миллилитров клеточной суспензии, совершает 1400 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Во время центрифугирования удалите и выбросьте раствор коллагена из заранее подготовленной трансвелл-пластины. Оставьте тарелку сохнуть под капотом на пять минут, затем дважды промойте PBS после окончательной стирки. После центрифугирования отасуньте все PBS и пипетку 1,5 миллилитра пролиферирующей среды в базальный отсек транслунки.

Отбрасывают супинат и ресуспендируют клеточную гранулу в соответствующем объеме пролиферирующей среды, чтобы облегчить осаждение в соотношении 7,5 умножить на 10 к четырем к 10 к пяти клеткам в 500 микролитрах суспензии на лунку. Пипеткой внесите 500 микролитров клеточной суспензии на апикальную поверхность трансмировой поликарбонатной мембраны. Вставка. Инкубируйте погруженные культуры MTEC при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе, содержащем 95% воздуха и 5% углекислого газа, в течение 7–10 дней, меняя среду через день.

Измерьте сопротивление трансэпителиальных клеток с помощью интервалометра. Когда сопротивление эпителия достигает 1000 Ом на квадратный сантиметр и культуры кажутся сливающимися. Преобразуйте в культуру LI, удалив апикальную среду.

Также замените базальную среду на основную среду MTEC, содержащую 2% новой сыворотки и ретиноевую кислоту. Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 10–14 дней, чтобы обеспечить дифференциацию при смене среды через день. Во-первых, настройте коптильню в соответствии с инструкциями производителя.

Запишите вес неиспользованного фильтра pole flex. Затем поместите фильтр во встроенный держатель из нержавеющей стали на пробоотборную трубку, ведущую от отверстия для отбора проб в коптильной камере к насосу с постоянным потоком. Подключите блок отбора проб к газовому счетчику с помощью выпускной трубки с помощью системы воздействия ячейки CS.

Познакомьте апикальную сторону трансмировых культур с основным сигаретным дымом от трех сигарет с референсным фильтром R four F. Подвергайте клетки воздействию дыма от одной-двух сигарет. Подвергайте контрольные культуры воздействию комнатного воздуха в течение эквивалентного периода воздействия после того, как отбор проб газа набирает вес.

В фильтре плавного хода пула нормализуется общий материал, нанесенный на фильтр в миллиграммах. Для общего объема отобранного воздуха дым от одной-двух сигарет обычно дает от 100 до 200 миллиграммов на кубический метр TPM. После воздействия сигарет соберите клетки и базальную среду для дальнейших анализов.

Это пример здорового монослоя респираторных эпителиальных клеток мыши, окрашенного на ядерные эпителиальные клетки, и маркеры С. Для успешной изоляции, пролиферации и дифференцировки эпителия используется неповрежденный монослой с морфологией булыжника. Культуры практически не содержат фибробластов.

Эти изображения с помощью электронных микрофотографий являются репрезентативными для здоровых культур MTEC и отображают ультраструктуру различных типов клеток и морфологию CELIA. Это видео с визуализацией живых клеток показывает здоровую морфологию C культур MTEC. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изолировать эпителиальные клетки трахеи мыши, дифференцировать их в воздушной жидкости и подвергать воздействию обычного сигаретного дыма.