Сбор переменной концентрации Изотермические наборов калориметрия титрования с целью определения обязательных механизмов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить правильную физическую модель, описывающую связывание макромолекулы с ее лигандом, и определить связанные с этим термодинамические параметры. Это достигается путем предварительного приготовления исходного раствора макромолекулы путем обширного диализа. Затем представляющий интерес лиганд растворяют в окончательном диализном буфере, а на втором этапе определяют концентрации всех компонентов.

Образцы макромолекул и лигандов тщательно разбавляют до ряда различных концентраций. Затем проводится серия экспериментов с изотермическим титрованием, калориметрией, или ITC, при нескольких концентрациях лиганда и белка для получения серии изотерм ITC на заключительном этапе процедуры. Глобальный анализ серии экспериментов проводится с использованием различных физических моделей, и модель, дающая наилучшее общее согласие, определяется как верная.

Сегодня я покажу вам метод, который может помочь ответить на биофизические вопросы, например, как белковые молекулы связывают свои лиганды, и может обеспечить точные измерения параметров связывания, таких как энтропия, энтропия и ассоциативные константы. Очистите интересующий вас белок Макромолекула, используемая в этой демонстрации, представляет собой иммуногликозид N шесть прайм, тонкий трансфераза один I или C шесть прайм, I.To начать приготовить четыре литра диализного буфера и охладить до четырех градусов Цельсия. Далее диализуйте небольшой объем раствора макромолекулы.

При этом пять миллилитров 400 микромолярного AAC C шести прайм, один глаз на 1,3 литра диализного буфера при четырех градусах Цельсия. Это можно делать в холодильной камере или холодильнике, обменивать свежим буфером каждые восемь часов и проводить диализ в общей сложности три раза. Сохраните окончательный раствор для диализа.

Отфильтруйте 750 миллилитров готового диализного раствора через целлюлозный фильтр 0,45 микрона и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Этот буфер, который теперь называется рабочим буфером, будет использоваться для полоскания и в качестве разбавителя. Для образцов тщательно промойте шприцевой фильтр 0,2 микрона с работающим буфером.

Нанесите образец белка и процедите. Аккуратно соберите образец в коническую пробирку перед хранением белкового раствора, определите концентрацию белка с помощью стандартного белкового анализа. В этом случае концентрация белка измеряется с помощью ABSORBENCE на 280 нанометрах и рассчитывается концентрация фермента.

Используя коэффициент экстинкции, сгенерированный протеомным сервером EXI, храните белок таким образом, чтобы максимизировать долгосрочную стабильность. AAC C six prime one eye необходимо хранить при температуре четыре градуса Цельсия, так как он не сохраняет активность после замораживания и размораживания после последующего растворения лиганда и работающего буфера. Для этой демонстрации четыре миллиграмма ацетилкоэнзима А растворяли в 200 микролитрах проточного буфера для получения 25 миллимолярного исходного раствора.

Этот лиганд можно хранить при температуре минус 78 градусов Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к использованию для получения образцов ITC, сначала рассчитают концентрацию фермента для получения значения C 64, как описано в письменном протоколе для AAC six prime one I. Это соответствует концентрации 192 микромоляров. Приготовьте двухмиллилитровый раствор макромолекулы в этой концентрации, разбавив стоковый раствор с фильтрованным проточным буфером FIA для расплавления кофермента до оттаивания, ацеталь коэнзима раствором на ледяной водяной бане. После размораживания раствора кофермента ацеталя аккуратно рассчитайте концентрацию раствора лиганда, умножив концентрацию макромолекулы на число сайтов связывания, умноженное на 10.

Приготовьте раствор ацетильного кофермента, добавив 80 микролитров 25 миллимолярного коэнзима АПФ, стоковый раствор к 420 микролитрам проточного буфера и перемешайте. Перелейте разбавленный раствор ацетилкоэнзима ACE в пробирку для наполнения пипетки и верните оставшийся 25 миллимолярный исходный раствор до минус 78 градусов Цельсия для хранения. Дегазируйте растворы А С шесть прайм один глаз и тонкий коэнзим А раствор в вакууме в течение пяти минут при 19 градусах Цельсия, что на один градус Цельсия ниже желаемой экспериментальной рабочей температуры.

Чтобы установить инъекционный шприц, вставьте шприц через держатель шприца до тех пор, пока зажим для шприца, установленный на преме, не окажется на той же высоте, что и держатель. Наденьте зажим второго шприца на шприц для инъекций до тех пор, пока он не будет плотно прижат к дну держателя шприца. Осторожно затяните зажим с помощью прилагаемого шестигранного привода шариковой ручки 0,05 дюйма.

Далее поместите держатель шприца в держатель для пипетки. Осторожно вставьте инжектор пипетки в шприц для инъекций и убедитесь, что наконечник поршня подается непосредственно в отверстие шприца. После полной установки вкрутите стопорное кольцо держателя шприца в инжектор пипетки.

Перед загрузкой образца образца белка A a C six prime one eye используйте систему промывки клеток, поставляемую в комплекте с прибором, чтобы промыть ячейку образца не менее чем 50 миллилитрами проточного буфера. Удалите остаточный буфер из ячейки образца путем аспирации с помощью длинной иглы стеклянного шприца объемом 2,5 миллилитров. Удалите растворы из дегазационного вакуума с помощью второй чистой сухой длинной иглы.

Шприц объемом 2,5 миллилитров. Осторожно наберите в шприц не менее 1,8 миллилитров протеина А, С, С, Прайм, одного глаза. Соблюдайте осторожность, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха.

После того, как шприц будет загружен образцом белка, вставьте иглу в ячейку образца и осторожно коснитесь дна клетки. Поднимите иглу примерно на один миллиметр и осторожно введите образец в ячейку до тех пор, пока избыток жидкости не станет виден над верхней частью ячейки для образца. Чтобы очистить ячейку от любых захваченных пузырьков воздуха, поднимите иглу примерно на один сантиметр, убедившись, что раствор остается в переливе, и быстро извлеките и введите примерно 0,25 миллилитра раствора.

Теперь аккуратно проведите иглой вверх по краю перелива. В лунке образца игла будет ударяться о выступ. Удалите всю жидкость над этим выступом, так как выступ указывает на желаемую высоту для работающего раствора.

Чтобы загрузить шприц для инъекций, прикрепите шприц для раздувания пластиковой трубки к заливному порту и опустите наконечник поршня в верхнюю часть заливного отверстия. Теперь поместите пробирку для наполнения пипетки раствором лиганда DGA на дно держателя пипетки. Убедитесь, что наконечник шприца не касается дна заправочной трубки, и медленно набирайте раствор в шприц до тех пор, пока небольшое количество не попадет в трубку загрузочного шприца.

Далее закройте заливное отверстие, опустив наконечник поршня. Это делается нажатием на кнопку закрытия порта заполнения. Затем удалить пузырьки воздуха, которые могли застрять во время загрузки.

Очистите и заправьте, нажав кнопку продувки заправки. Продуйте и долейте в общей сложности три раза. После завершения процесса продувки извлеките заправочную трубку из держателя пипетки и аккуратно протрите наконечник шприца лабораторной папиросной бумагой.

Теперь опустите шприц пипетки в сборе в образец. Будьте осторожны и действуйте медленно, так как игла может легко согнуться. Убедитесь, что шприц полностью вставлен, надавливая на основание фиксирующего кольца.

Закрепив шприц, установите желаемую рабочую температуру и выберите эталонную мощность, которая немного больше ожидаемого максимального теплового потока впрыска. В этом примере 20 градусов Цельсия и 20 микрокалорий в секунду используются в качестве рабочей температуры и эталонной мощности соответственно. Затем запрограммируйте желаемые объемы впрыска и задержки.

Здесь используется 28 инъекций, первая из которых имеет объем два микролитра и 62-ю задержку, а последующие инъекции имеют объем 10 микролитров с 332-й задержкой. Продемонстрированный здесь эксперимент обеспечивает основу для создания набора данных с одной концентрацией для создания необходимых дополнительных кривых. Повторите этот процесс с уменьшением концентрации макромолекул и лигандов.

Убедитесь, что все образцы макромолекул и лигандов происходят из одного и того же исходного раствора, чтобы свести к минимуму погрешность в концентрациях. Здесь показан след калориметрии необработанной изотермического титрования, полученный в результате титрования 3,86 мкмольярного лиганда ацетилкоэнзима А в 192 микромоль микромолекулы. А А С шесть прайм.

Для определения параметров связывания с помощью последовательной посадки на двух участках использовались интегрированные значения глаза. На этом графике изображены изотермы, генерируемые ITC различных концентраций ACE Coenzyme A и AAC C six Prime One Eye. Экспериментальные данные, представленные разомкнутыми кругами, были подогнаны как к модели с двумя наборами сайтов, так и к модели с двумя последовательными сайтами.

Лучшее согласование наблюдается при использовании модели с двумя последовательными сайтами. Используемые концентрации белка определены в сопроводительном тексте. При выполнении этой процедуры важно быть очень точным с разбавлением, так как изменение концентраций может оказать значительное влияние на ваши результаты.