Сбор переменной концентрации Изотермические наборов калориметрия титрования с целью определения обязательных механизмов

Общая цель данной процедуры заключается в подборе подходящей физической модели, описывающей связывание макромолекулы с ее лигандом, и определении соответствующих термодинамических параметров. Для этого сначала подготавливают стоковый раствор макромолекулы путем тщательного диализа. Затем исследуемый лиганд растворяют в конечном диализном буфере, после чего на втором этапе определяют концентрации всех компонентов.

Образцы макромолекул и лигандов тщательно разводят до серии различных концентраций. Затем проводится серия экспериментов по изотермической титрационной калориметрии (ИТК) при нескольких концентрациях как лиганда, так и белка, чтобы на заключительном этапе процедуры получить серию ИТК-изотерм. Глобальный анализ серии экспериментов выполняется с использованием различных физических моделей, и модель, обеспечивающая наилучшее общее соответствие, определяется как верная.

Сегодня я продемонстрирую вам метод, который поможет ответить на биофизические вопросы, такие как механизм связывания молекул белка с их лигандами, и позволит получить точные значения параметров связывания, включая энтропию и константы ассоциации. Перед началом данного протокола очистите интересующий вас белок; в качестве макромолекулы в данной демонстрации используется immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I или a C six prime one I. Для начала приготовьте четыре литра диализного буфера и охладите его до 4 °C. Затем проведите диализ небольшого объема раствора макромолекулы.

В данном случае пять миллилитров 400 µM AAC C 6', 1I в 1,3 л диализного буфера при 4 °C. Эту процедуру можно проводить в холодильной камере или холодильнике; заменяйте буфер на свежий каждые восемь часов и проведите диализ в общей сложности три раза. Сохраните конечный диализный раствор.

Профильтруйте 750 миллилитров конечного диализного раствора через целлюлозный фильтр с порами 0,45 мкм и храните при температуре четырех градусов Цельсия. Этот буфер, который далее будет называться рабочим буфером, будет использоваться для промывки и в качестве разбавителя. Для подготовки образцов тщательно промойте шприцевой фильтр с порами 0,2 мкм рабочим буфером.

Нанесите образец белка и профильтруйте его. Осторожно соберите образец в коническую пробирку перед хранением белкового раствора, затем определите концентрацию белка с помощью стандартного метода анализа белков. В данном случае концентрация белка измеряется по АБСОРБЦИИ при 280 nanometers, после чего рассчитывается концентрация фермента.

Используя коэффициент экстинкции, рассчитанный с помощью протеомного сервера EXI, следует хранить белок таким образом, чтобы максимально обеспечить его долгосрочную стабильность. AAC C six prime one eye необходимо хранить при 4 °C, так как он теряет активность после замораживания и оттаивания; далее растворите лиганд и рабочий буфер. В данной демонстрации 4 mg ацетил-коэнзима А были растворены в 200 µL рабочего буфера для приготовления стокового раствора с концентрацией 25 mM.

Данный лиганд можно хранить при температуре -78 °C до начала подготовки образцов для ITC. Сначала рассчитайте концентрацию фермента для получения значения C, равного 64, как описано в письменном протоколе для AAC 6'1. Это соответствует концентрации 192 µM. Приготовьте 2 мл раствора макромолекулы с данной концентрацией, разбавив стоковый раствор отфильтрованным рабочим буфером. Разморозьте раствор ацеталь-коэнзима А в ледяной водяной бане. После размораживания осторожно перемешайте раствор ацеталь-коэнзима А. Рассчитайте концентрацию раствора лиганда, умножив концентрацию макромолекулы на количество центров связывания и на 10.

Приготовьте раствор ацетил-коэнзима А, добавив 80 µL стокового раствора 25 мМ ацетил-коэнзима А к 420 µL рабочего буфера и перемешав. Перенесите разбавленный раствор ацетил-коэнзима А в трубку для заполнения пипетки, а оставшийся стоковый раствор 25 мМ верните при температуре -78 °C для хранения. Дегазируйте растворы AC6'1I и ацетил-коэнзима А под вакуумом в течение пяти минут при 19 °C, что на 1 °C ниже требуемой рабочей температуры эксперимента.

Для подготовки шприца для инъекций вставьте его в держатель для шприцев так, чтобы предварительно установленный зажим для шприца находился на одном уровне с держателем. Наденьте второй зажим для шприца на шприц для инъекций, пока он плотно не прижмется к нижней части держателя для шприцев. Осторожно затяните зажим с помощью прилагаемого шестигранного ключа с шариковым наконечником размером 0.05 inch.

Затем поместите держатель шприца в держатель пипетки. Осторожно вставьте инжектор пипетки в инъекционный шприц и убедитесь, что наконечник поршня расположен точно напротив отверстия шприца. После полной установки закрутите фиксирующую гайку держателя шприца в инжекторе пипетки.

Перед нанесением раствора образца белка A a C six prime one eye используйте систему промывки кювет, входящую в комплект прибора, чтобы промыть кювету для образца не менее чем 50 milliliters рабочего буфера. Удалите остатки буфера из кюветы для образца путем аспирации с помощью стеклянного шприца объемом 2.5 milliliter с длинной иглой. Удалите растворы из вакуумного дегазатора, используя вторую чистую сухую длинную иглу.

Шприц объемом 2,5 мл. Осторожно наберите в шприц не менее 1,8 мл образца белка A a C six prime one eye. Будьте внимательны, чтобы избежать появления пузырьков воздуха.

После того как шприц будет заполнен образцом белка, введите иглу в кювету и осторожно коснитесь ее дна. Поднимите иглу примерно на один миллиметр и аккуратно введите образец в кювету до тех пор, пока над ее верхним краем не появится излишек жидкости. Чтобы удалить из кюветы возможные пузырьки воздуха, поднимите иглу примерно на один сантиметр, следя за тем, чтобы раствор оставался в области перелива, затем быстро отведите и снова введите примерно 0,25 миллилитра раствора.

Теперь осторожно переместите иглу вверх вдоль стенки перелива. В лунке для образца игла упрется в выступ. Отоберите всю жидкость выше этого выступа, так как он указывает требуемый уровень рабочего раствора.

Для заполнения инъекционного шприца прикрепите пластическую трубку шприца для наполнения к порту заполнения и опустите наконечник поршня до верхнего края порта. Затем поместите трубку пипетки с раствором лиганда DGAs в нижнюю часть держателя пипетки. Убедитесь, что кончик шприца не касается дна трубки для наполнения, и медленно втяните раствор в шприц, пока небольшое количество жидкости не поступит в трубку загрузочного шприца.

Затем закройте заправочное отверстие, опустив наконечник плунжера. Для этого нажмите кнопку закрытия заправочного отверстия. После этого удалите все пузырьки воздуха, которые могли образоваться во время загрузки.

Выполните продувку и заполнение, нажав кнопку «purge refill». Повторите процедуру продувки и заполнения в общей сложности три раза. По завершении процесса продувки и заполнения извлеките трубку для заполнения из держателя пипетки и аккуратно протрите кончик шприца лабораторной салфеткой.

Теперь опустите шприц блока пипеток в образец. Действуйте осторожно и медленно, так как игла может легко погнуться. Убедитесь, что шприц введен полностью, нажав на основание стопорного кольца.

После закрепления шприца установите желаемую рабочую температуру и выберите опорную мощность, которая немного превышает максимально ожидаемый тепловой поток при инъекции. В данном примере в качестве рабочей температуры и опорной мощности используются 20 °C и 20 мкал/с соответственно. Затем запрограммируйте необходимые объемы инъекций и задержки.

В данном случае используется 28 инъекций, при этом объем первой составляет 2 µL с задержкой 62 с, а объем последующих инъекций — 10 µL с задержками 332 с. Описанный здесь эксперимент служит основой для создания набора данных при одной концентрации, что позволит построить необходимые дополнительные кривые. Повторите этот процесс, постепенно снижая концентрации макромолекулы и лиганда.

Убедитесь, что все образцы макромолекул и лигандов получены из одного и того же стокового раствора, чтобы минимизировать погрешность в концентрациях. Здесь показана необработанная кривая изотермической титрационной калориметрии, полученная при титровании 3.86 millimolar лиганда ацетил-коэнзима А в 192 micromolar микромолекулы A A C six prime one.

Интегральные значения сигналов использовались для определения параметров связывания с помощью последовательной аппроксимации по двум центрам. На данном графике представлены изотермы, полученные методом ITC при различных концентрациях ACE Coenzyme A и AAC C six Prime One Eye. Экспериментальные данные, представленные открытыми кружками, были аппроксимированы как по модели с двумя независимыми центрами связывания, так и по модели с двумя последовательными центрами связывания.

Лучшее соответствие наблюдается при использовании двухсайтовой последовательной модели. Используемые концентрации белка определены в сопроводительном тексте. При выполнении данной процедуры важно соблюдать высокую точность при разведении, так как изменение концентраций может оказать резкое влияние на ваши результаты.