Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

В этой процедуре используется чип Viro, вирусный микрочип для анализа клинических образцов на наличие как известных, так и неизвестных вирусов. Первые нуклеиновые кислоты экстрагируются из клинических образцов. Затем извлеченная РНК реверсивно транскрибируется с использованием случайных праймеров.

Выполняется синтез CD NA второй цепи и амплификация библиотеки CD NA с помощью случайной ПЦР. Затем амплифицированный cd NA помечают флуоресцентными красителями и гибридизируют с вирусным чиповым микрочипом. Заключительным этапом является сканирование и анализ микрочипа.

В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают наличие или отсутствие вируса или нескольких вирусов с помощью микрочипа с помощью чипа. Методы обнаружения широкого спектра действия, такие как вирусный чип-микрочип, необходимы в диагностической микробиологии, поскольку распространенные клинические синдромы, такие как пневмония, не специфичны для какого-либо отдельного патогена, а также из-за постоянно возникающей угрозы новых вирусных патогенов, таких как коронавирус SARS и новый вирус гриппа H one N one 2009 года, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностической микробиологии. например, какой процент недиагностированных инфекций в клинических условиях может быть вызван еще не идентифицированными новыми вирусами. Применение этого метода распространяется на более точную диагностику острого клинического заболевания в больнице, потому что мы одновременно проверяем на сотни и тысячи потенциальных патогенов.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову в 2002 году, когда мы решили применить недавно разработанную технологию микрочипов, впервые разработанную в лаборатории доктора Джозефа ДеРизи в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, для обнаружения вирусов. В 2003 году мы впервые провели испытание с использованием вирусного чипа для идентификации нового коронавируса, вызывающего атипичную пневмонию, и техник из моей лаборатории продемонстрирует использование анализа вирусного чипа на образце мазка из носа у ребенка для диагностики причины ее острого респираторного заболевания. Образцы мазков из носоглотки собираются в стерильные контейнеры, содержащие вирусный транспорт, жидкие среды, и хранятся в замороженном виде при температуре минус 80 градусов Цельсия.

В колпаке с биобезопасностью дайте пробирке с образцом оттаять и кратковременно перемешайте тампон в среде, прежде чем выбрасывать тампон в биологически опасное контейнерное ведро. Затем аликвотируем 200 микролитров образца в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Пропустите образец через спиновой фильтр 0,22 микрона для очистки от вирусных частиц и поместите в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем используйте набор Turbo DNA от Ambien в соответствии с инструкциями производителя, чтобы разрушить геномную ДНК хозяина и очистить ее для защищенной инкапсулированной вирусной нуклеиновой кислоты. Затем следует экстракция РНК с помощью набора для экстракции вирусной РНК XMO ZR или набора для удаления вирусов Qiagen ultrasound в соответствии с инструкциями производителя. Измерьте концентрацию экстрагированной РНК с помощью спектрофотометра нуклеиновых кислот NanoDrop.

Концентрация РНК предпочтительно составляет не менее 10 нанограмм на микролитр, но будет варьироваться от образца к образцу при использовании тонкостенной пробирки объемом 200 микролитров. Добавьте один микролитр праймера А в концентрации 40 молей PICA на микролитр к четырем микролитрам экстрагированной РНК. Нагрейте образец до 65 градусов Цельсия в течение пяти минут в термоамплификаторе, а затем дайте пробирке остыть до комнатной температуры в течение пяти минут.

Затем добавьте пять микролитров мастер-смеси, содержащей два микролитра пятикратного RT-буфера, один микролитр 12,5 мкмоль, DNTP один микролитр воды 0,5 мкл, 0,1 моляра DTT и 0,5 мкл верхнего индекса три, обратную транскриптазу в термоциклере. Инкубируйте пробирку при температуре 42 градуса Цельсия в течение 60 минут. Затем нагрейте образец до 94 градусов Цельсия в течение двух минут.

Чтобы прервать реакцию обратной транскриптазы, необходимо вызвать температуру до 10 градусов Цельсия в течение двух минут и провести пульсацию в течение пяти секунд. Далее добавьте пять микролитров смеси, состоящей из одного микролитра пятикратного буфера для квазы, 3,8 микролитра воды и 0,15 микролитра для синтеза второй цепи. Нагрейте термоамплификатор с 10 градусов Цельсия до 37 градусов Цельсия в течение восьми минут.

Подержите при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми минут. Затем нагрейте до 94 градусов Цельсия в течение двух минут, чтобы активировать тошноту, и к этому моменту позвоните до 10 градусов Цельсия. При желании храните образец, содержащий 15 микролитров CDNA, при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Во-первых, добавьте пять микролитров образца CD NA к 45 микролитрам мастер-смеси, состоящей из пяти микролитров 10-кратного буфера для ПЦР, одного микролитра 12,5 миллимоляра, DNTP одного микролитра 100 помо на микролитр праймера, B одного микролитра cleantech LA и 37 микролитров воды. Затем запустите протокол ПЦР следующим образом: 94 градуса Цельсия в течение двух минут, затем 25 циклов по 94 градуса Цельсия в течение 30 секунд. 50 градусов Цельсия в течение 45 секунд и 72 градуса Цельсия в течение одной минуты.

Затем шаг на колени с температурой 72 градуса Цельсия в течение пяти минут, а затем задержка при 10 градусах Цельсия после ПЦР. Проверьте продукт для ПЦР и 1,5% гель для электрофореза AOSE. Следует визуализировать мазок примерно от 200 до 1000 пар оснований.

Чтобы включить AAD DNTP, добавьте пять микролитров вирусного продукта ПЦР к 45 микролитрам мастер-смеси, состоящей из пяти микролитров 10-кратного буфера для ПЦР, одного микролитра 12,5 миллимоляра, одного микролитра 100 микролитров многократного праймера, B одного микролитра ClinTech LA и 37 микролитров воды. Запустите протокол ПЦР следующим образом: 94 градуса Цельсия в течение двух минут, 15 циклов по 94 градуса Цельсия в течение 30 секунд. 50 градусов Цельсия в течение 45 секунд.

72 градуса Цельсия в течение одной минуты и коленопреклоненный шаг 72 градуса Цельсия в течение пяти минут и удерживайте при температуре 10 градусов Цельсия. Затем очистите новый продукт ПЦР с помощью набора DNA Clean и концентратора три в соответствии с инструкциями производителя и добавьте 10 микролитров элюирующего буфера. Добавьте один микролитр одного молярного бикарбоната и один микролитр трех микролитров к 10 микролитрам продукта ПЦР и выдерживайте в течение часа в темноте.

Далее, опять же, очистите меченный S образец с помощью набора ДНК и концентратора 5 и разбавьте 12 микролитров элюирующего буфера. Используйте 1,5 микролитра образца для проверки концентрации КДНК и количества красителя, включенного на спектрофотометре NanoDrop в полосковую пробирку для ПЦР в одном микролитре, 25-кратном фрагментирующем буфере, пяти микролитрах, пятикратном блокирующем буфере 9,5 микролитров или количестве, необходимом для нормализованной конечной концентрации в 10 пиковых или молей на микролитр СИ, трех меченых образцах и воде до общего объема 25 микролитров. Затем добавьте 25 микролитров двухкратного буфера для гибридизации GX, и кратковременно уменьшите, чтобы удалить пузырьки.

Поместите новую прокладочную заслонку в камеру гибридизации. Загрузите 40 микролитров образца на предметное стекло прокладки. Затем поместите напечатанный вирусный массив Agilent с маркировкой Agilent вниз на верхнюю часть ползуна прокладки и плотно затяните винт.

Поместите камеру гибридизации в духовку при температуре 65 градусов Цельсия и гибридизуйте в течение ночи, используя медленное вращение 10 оборотов в минуту, чтобы промыть массивы. Сначала разогрейте буфер от двух до 37 градусов Цельсия во время нагрева. Заполните пластиковую емкость объемом 500 миллилитров примерно 250 миллилитров буфера. Один.

Извлеките массив из камеры гибридизации, погрузите массив в воду и отделите его от предметного стекла прокладки. Переложите массив в чистую емкость и промойте в буфере по одному в течение одной минуты. Затем используют отдельную пластиковую емкость объемом 500 миллилитров.

Промойте массив в предварительно разогретом буфере два в течение одной минуты. После промывки медленно извлеките массив из буфера. Во-вторых, будьте осторожны, избегайте образования пузырей.

Используйте салфетку kim для отвода лишней влаги, стараясь при этом не касаться непосредственно активной стороны массива. Наконец, поместите предметное стекло в держатель слайда Agilent стороной вверх и вставьте в матрицу сканера. В этой процедуре мы используем двухмикронный ДНК-микронный микрочип Agilent.

Отсканируйте трехмеченую матрицу SI на расстоянии пяти микрон или двух микрон в соответствии со стандартным протоколом сканирования прибора. Анализируйте микрочипы вирусных чипов с помощью кластерного анализа или автоматизированной программы анализа чипов обратного осмоса и без ошибок. С помощью микрочипа Viro Chipp 2009 новый вирус гриппа H One N one легко обнаруживается в образце мазка из носа, полученном от ребенка с гриппоподобным заболеванием.

Кроме того, мы показали, что вирусный чип способен идентифицировать не только респираторные вирусы, но и широкий спектр вирусов из различных тканей и жидкостей организма. Некоторые примеры обнаружения вируса в цельной крови и сыворотке с помощью вичи, как показано здесь. Это вызовы, соответствующие микроизлучению viro чипа из образцов крови, либо цельной крови, либо сыворотки, взятой у четырех пациентов для каждого образца, показаны два верхних прогноза вируса, при этом верхний прогноз вируса имеет наименьшее значение P.

Например, в образце, выделенном светло-голубым цветом, основным прогнозом для этого образца является вирус денге первого типа. В то время как вторым по рангу прогнозом является вирус денге второго типа, фактический вирус в этом образце цельной крови действительно был подтвержден как вирус денге первого типа, что согласуется с результатами dict. Еще одно применение чипа viro — открытие новых патогенов.

Некоторые примеры включают открытие коронавируса SARS X-M-R-V-A, ретровируса OME, связанного с раком предстательной железы и синдромом хронической усталости у людей, и HTCV, нового сердечно-сосудистого вируса человека, связанного с респираторными и диарейными инфекциями у детей после освоения. Эту методику можно сделать за 12 часов, если она выполнена правильно. Приступая к этой процедуре, важно помнить о необходимости обеспечить наличие всего необходимого оборудования и реагентов после этой процедуры.

Другие методы, такие как специфическая вирусная ПЦР-амплификация и глубокое секвенирование, могут быть выполнены для подтверждения и отслеживания необычных моделей гибридизации вирусных чипов или результатов вирусных чипов, которые предполагают присутствие нового вируса после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области онкологии к изучению связи новых вирусов с раком в области биозащиты и клинической микробиологии для разработки конденсированных микроанализов для быстрой диагностики патогенов, а в области вирусологии — для характеристики новых вирусов и их связи с болезнями. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять все этапы микролучевого анализа вирусного чипа, теста широкого спектра наблюдения для обнаружения вирусных патогенов в клинических образцах, начиная с экстракции нуклеиновых кислот, от клинических образцов до микролучевой гибридизации и анализа.

Не забывайте, что работа с клиническими образцами считается биологически опасной, и экстракцию нуклеиновых кислот следует проводить в лабораториях с уровнем биобезопасности два или выше.