Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

В данной процедуре используется чип Viro — панвирусный микрочиповый анализ для исследования клинических образцов на наличие как известных, так и неизвестных вирусов. Сначала из клинических образцов экстрагируют нуклеиновые кислоты. Затем экстрагированную РНК подвергают обратной транскрипции с использованием случайных праймеров.

Проводится синтез второй цепи кДНК, после чего библиотека кДНК амплифицируется с помощью ПЦР со случайными праймерами. Затем амплифицированная кДНК маркируется флуоресцентными красителями и гибридизируется с вирусным микрочипом. Заключительным этапом является сканирование и анализ микрочипа.

В конечном итоге, путем анализа микрочипа можно получить результаты, подтверждающие наличие или отсутствие одного или нескольких вирусов. Методы обнаружения широкого спектра, такие как вирусные микрочипы, необходимы в диагностической микробиологии, поскольку распространенные клинические синдромы, такие как пневмония, не являются специфичными для какого-либо одного патогена, а также из-за постоянной возникающей угрозы новых вирусных патогенов, таких как коронавирус SARS и новый вирус гриппа H1N1 2009 года. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностической микробиологии, например, какой процент недиагностированных инфекций в клинических условиях может быть вызван еще не идентифицированными новыми вирусами. Применение этой методики способствует более точной диагностике острых клинических заболеваний в стационаре, поскольку мы проводим одновременное тестирование на сотни или тысячи потенциальных патогенов.

Идея этого метода впервые возникла у нас в 2002 году, когда мы решили применить недавно разработанную технологию микрочипов, созданную в лаборатории доктора Джозефа ДеРизи в UCSF, для обнаружения вирусов. Нашим первым практическим тестом стало использование вирусного чипа для идентификации нового коронавируса, вызвавшего SARS в 2003 году. Процедуру от начала до конца продемонстрирует технический специалист моей лаборатории, который покажет применение анализа на вирусном чипе с использованием образца мазка из носа ребенка для диагностики причины ее острого респираторного заболевания. Образцы мазков из носоглотки собирают в стерильные контейнеры, содержащие жидкую вирусную транспортную среду, и хранят в замороженном виде в морозильнике при температуре -80 °C.

В боксе биологической безопасности дайте пробирке с образцом разморозиться и кратковременно перемешайте тампон в среде, после чего утилизируйте тампон в контейнер для биоопасных отходов. Затем перенесите 200 µL образца в пробирку объемом 1,5 мл. Пропустите образец через центрифужный фильтр с порами 0,22 мкм для очистки вирусных частиц в новую пробирку объемом 1,5 мл.

Затем, используя набор Turbo DNA от компании Ambien в соответствии с инструкциями производителя, удалите геномную ДНК хозяина и проведите очистку инкапсулированной вирусной нуклеиновой кислоты. После этого выполните экстракцию РНК с помощью набора для экстракции вирусной РНК XMO ZR или набора Qiagen ultrasound's virus в соответствии с инструкциями производителя. Измерьте концентрацию экстрагированной РНК с помощью спектрофотометра нуклеиновых кислот NanoDrop.

Концентрация РНК предпочтительно составляет не менее 10 ng/µL, однако она может варьироваться от образца к образцу при использовании тонкостенной пробирки объемом 200 µL. Добавьте 1 µL праймера А с концентрацией 40 пмоль/µL к 4 µL экстрагированной РНК. Нагрейте образец до 65 °C в течение пяти минут в термоциклере, после чего дайте пробирке остыть до комнатной температуры в течение пяти минут.

Затем в термоциклере добавьте пять µL мастер-микса, содержащего две µL 5× RT-буфера, одну µL 12,5 mM dNTP, одну µL воды, 0,5 µL 0,1 M DTT и 0,5 µL обратной транскриптазы. Инкубируйте пробирку при 42 °C в течение 60 минут. Затем нагрейте образец до 94 °C на две минуты.

Для прекращения реакции обратной транскрипции выдержите смесь при температуре 10 °C в течение двух минут и центрифугируйте в режиме короткого осаждения (пульс-центрифугирование) в течение пяти секунд. Затем добавьте 5 µL смеси qease, состоящей из 1 µL 5-кратного буфера qease, 3,8 µL воды и 0,15 µL смеси для синтеза второй цепи qease. Плавно поднимите температуру в термоциклере с 10 °C до 37 °C в течение восьми минут.

Выдержите при 37 °C в течение восьми минут. Затем нагрейте до 94 °C в течение двух минут для инактивации фермента, после чего охладите до 10 °C. При необходимости образец, содержащий 15 µL кДНК, храните при -20 °C.

Сначала добавьте 5 µL образца CD NA к 45 µL мастер-микса, состоящего из 5 µL 10-кратного ПЦР-буфера, 1 µL 12,5 мМ dNTP, 1 µL праймера B в концентрации 100 пмоль/µL, 1 µL Cleantech LA и 37 µL воды. Затем проведите ПЦР по следующему протоколу: 94 °C в течение 2 минут, затем 25 циклов, включающих 94 °C в течение 30 секунд, 50 °C в течение 45 секунд и 72 °C в течение 1 минуты.

Затем следует этап отжига при 72 °C в течение пяти минут, после чего по завершении ПЦР следует выдержка при 10 °C. Проверьте ПЦР-продукт с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Должен быть визуализирован шлейф примерно от 200 до 1000 пар оснований.

Для включения AAD DNTP добавьте 5 µL продукта вирусной ПЦР к 45 µL мастер-микса, состоящего из 5 µL 10-кратного ПЦР-буфера, 1 µL 12,5 мМ A-A-D-N-T-P, 1 µL 100 пМ праймера B, 1 µL ClinTech LA и 37 µL воды. Выполните протокол ПЦР следующим образом: 94 °C в течение 2 минут, затем 15 циклов, включающих 94 °C в течение 30 секунд и 50 °C в течение 45 секунд.

72 °C в течение одной минуты, затем этап отжига при 72 °C в течение пяти минут и выдержка при 10 °C. Затем очистите полученный ПЦР-продукт с помощью набора DNA clean and concentrator three согласно инструкциям производителя и доведите объем до 10 µL буфера для элюции. Добавьте 1 µL 1 M бикарбоната и 1 µL si three к 10 µL ПЦР-продукта и инкубируйте в течение одного часа в темноте.

Затем снова очистите образец, меченный S, с помощью набора DNA clean and concentrator five и элюируйте в 12 µL элюирующего буфера. Используйте 1,5 µL образца для проверки концентрации кДНК и количества вклюжденного красителя на спектрофотометре NanoDrop в ПЦР-стрип-пробирке, добавив 1 µL 25-кратного фрагментационного буфера, 5 µL 5-кратного блокирующего буфера, 9,5 µL или необходимого объема для достижения нормализованной конечной концентрации 10 пмоль/µL меченного S образца и воду до общего объема 25 µL. Затем добавьте 25 µL 2-кратного гибридизационного буфера GX и кратковременно центрифугируйте для удаления пузырьков.

Поместите новый предметное стекло с прокладкой в камеру гибридизации. Нанесите 40 µL образца на предметное стекло с прокладкой. Затем поместите напечатанную вирусную микроматрицу Agilent стороной с маркировкой Agilent вниз поверх предметного стекла с прокладкой и плотно затяните винт.

Поместите камеру гибридизации в печь при температуре 65 °C и проведите гибридизацию в течение ночи при медленном вращении со скоростью 10 об/мин для промывки массивов. Сначала предварительно нагрейте буфер два до 37 °C в процессе нагрева. Наполните пластиковый контейнер объемом 500 мл примерно 250 мл буфера один.

Извлеките массив из камеры гибридизации, погрузите его в жидкость и отделите от предметного стекла с прокладкой. Перенесите массив в чистый контейнер и промойте в буфере один в течение одной минуты. Затем используйте отдельный пластиковый контейнер объемом 500 миллилитров.

Промойте массив в предварительно нагретом буфере 2 в течение одной минуты. После промывки медленно извлеките массив из буфера 2, стараясь избегать образования пузырьков.

Используйте салфетку Kimwipe, чтобы удалить излишки влаги, стараясь не касаться непосредственно активной стороны массива. В завершение поместите предметное стекло в держатель активной стороной (стороной Agilent) вверх и установите в сканер массивов. В данной процедуре мы используем сканер ДНК-микромассивов Agilent two micron.

Просканируйте массив из трех меченых SI на разрешении 5 мкм или 2 мкм в соответствии со стандартным протоколом сканирования прибора. Проанализируйте вирусные микрочипы с помощью кластерного анализа или автоматизированной программы анализа микрочипов RO e unpredic. С использованием микрочипа Viro Chipp 2009 новый вирус гриппа H1N1 легко обнаруживается в образце мазка из носа, полученном от ребенка с гриппоподобным заболеванием.

Кроме того, мы продемонстрировали, что вирусный чип способен идентифицировать не только респираторные вирусы, но и широкий спектр вирусов из различных тканей и биологических жидкостей. Здесь представлены некоторые примеры обнаружения вирусов в цельной крови и сыворотке с использованием vichi. Это результаты микрочипа viro chip для образцов крови (цельной крови или сыворотки), взятых у четырех пациентов для каждого образца; показаны два наиболее вероятных предсказания вируса, при этом наиболее вероятное предсказание имеет наименьшее значение P.

Например, для образца, выделенного светло-голубым цветом, основным прогнозируемым результатом является вирус денге 1-го типа. Хотя на втором месте находится вирус денге 2-го типа, фактическое наличие вируса в данном образце цельной крови действительно было подтверждено как вирус денге 1-го типа, что согласуется с результатами дик-теста. Еще одна область применения ViroChip — поиск новых патогенов.

Примеры включают обнаружение коронавируса SARS X-M-R-V-A, ретровируса OME, связанного с раком предстательной железы и синдромом хронической усталости у людей, а также HTCV — нового кардиовируса человека, ассоциированного с респираторными и диарейными инфекциями у детей. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает 12 часов. При выполнении данной процедуры важно убедиться в наличии всего необходимого оборудования и реагентов, указанных ниже.

Для подтверждения и дальнейшего изучения необычных паттернов гибридизации на вирусном чипе или результатов, указывающих на присутствие нового вируса, могут быть применены другие методы, такие как специфическая ПЦР-амплификация вирусных последовательностей и глубокое секвенирование. Разработка данной методики открыла исследователям в области онкологии возможность изучать связь новых вирусов с раком, специалистам в области биозащиты и клинической микробиологии — создавать компактные тесты на основе микрочипов для экспресс-диагностики патогенов, а вирусологам — характеризовать новые вирусы и определять их связь с заболеваниями. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о выполнении всех этапов анализа с использованием вирусного микрочипа — теста широкого спектра для мониторинга вирусных патогенов в клинических образцах, начиная от экстракции нуклеиновых кислот из биоматериала и заканчивая гибридизацией на микрочипе и последующим анализом.

Не забывайте, что работа с клиническими образцами считается биологически опасной, и экстракция нуклеиновых кислот должна проводиться в лабораториях с уровнем биологической безопасности 2 или выше.