Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном и недорогом профилировании экспрессии микроРНК с использованием минимального количества исходного материала путем сочетания мультиплексной количественной ОТ-ПЦР с микрофлюидной платформой. Процесс начинается с концентрирования экстрагированной РНК, после чего следуют мультиплексная обратная транскрипция и мультиплексная преамплификация. Следующим этапом является очистка от избытка праймеров.

Наконец, профилирование экспрессии единичных микроРНК проводится с использованием микрофлюидной платформы. Результатом являются точные и высоковоспроизводимые уровни экспрессии микроРНК в исследуемых образцах. Основным преимуществом данного метода перед существующими является то, что дополнительный этап очистки после пре-EMP амплификации повышает точность и воспроизводимость метода мультиплексной Q-R-T-P-C-R.

Начните с РНК, экстрагированной из сыворотки. При использовании набора для очистки РНК или метода экстракции РНК на основе фенол-хлороформа из гомогенизированной ткани, такой как триол, за каждой экстракцией должен следовать этап промывки, а хранение должно осуществляться при температуре -80 °C. Сконцентрируйте раствор РНК.

Если вы начинаете с ограниченного количества образца, например, из сыворотки, сначала вставьте резервуар для образцов MicroCon в пробирку, затем перенесите раствор РНК в резервуар с помощью пипеток, стараясь не касаться мембраны наконечником пипетки. Теперь поместите пробирку с фильтром в центрифугу так, чтобы полоса с трещиной была обращена к ротору, и центрифугируйте в течение примерно трех часов. Через три часа РНК будет полностью сконцентрирована на мембране для последующего элюирования РНК.

Добавьте желаемое количество РНК-бесводной среды на мембрану, переверните резервуар и перенесите содержимое в новый флакон. Затем центрифугируйте в течение трех минут при температуре 4 °C с максимальным ускорением 3000 ×g. Храните концентрированную РНК при температуре -80 °C до использования. После проведения реакции обратной транскрипции (ОТ) РНК с использованием xpl-праймеров в виде шпилечной структуры с последующим проведением 12–18 циклов ПЦР микроРНК будут представлены в виде цепей кДНК.

Это так называемый пре-ПЦР продукт. В преддверии предстоящей количественной ПЦР (кПЦР) пре-ПЦР продукт необходимо очистить на 10% полиакриламидном геле вместе с маркером ДНК с разрешением 10 пар оснований; в каждую лунку внесите 5,5 µL 6x оранжевого красителя G, смешанного с 27,5 µL пре-ПЦР продукта.

Проводите электрофорез в геле при напряжении 150 вольт в течение 55–60 минут. Феноловый синий Romo в таком геле мигрирует в области 20 пар оснований. После завершения электрофореза окрасьте гель красителем cyber gold в течение 25 минут в защищенном от света месте на шейкере.

Вырежьте полосу продукта ПЦР размером от 60 до 80 пар оснований и перенесите фрагмент геля в маркированные пробирки. Если концентрация продукта низка, полоса может быть не видна, однако продукт все равно останется в геле. Затем измельчите полосу геля методом центрифугирования «пробирка в пробирке» и добавьте 300 µL буфера TEN.

Инкубируйте смесь буфера и геля в течение четырех часов при 37 °C с перемешиванием. По истечении четырех часов перенесите жидкость в новую пробирку и добавьте еще 300 µL буфера TEN. Инкубируйте полученную смесь в течение ночи при 4 °C с перемешиванием.

На следующий день снова перенесите содержимое пробирки и проведите осаждение этанолом продукта пре-ПЦР. После вскрытия упаковки чип должен быть подготовлен в течение 24 часов, а затем загружен в течение 60 минут после подготовки. Начните подготовку матрицы, введя 150 microliters жидкости для контрольной линии в каждый из аккумуляторов на чипе.

Будьте осторожны, чтобы не пролить жидкость на чип или входные отверстия, иначе чип станет непригодным для использования. Затем поместите чип в контроллер интегрированной микрофлюидной схемы (IFC) и запустите скрипт заполнения (прайминга) контроллера. Как только программа начнется, приступайте к подготовке образцов.

Начните с приготовления смеси для образцов пре-амплификации. Смешайте TaqMan universal master mix и реагенты для загрузки. Затем, используя формат загрузки для 96-луночного планшета, объедините 2,25 µL каждого образца с 2,75 µL смеси для образцов пре-амплификации, чтобы получить жидкость для загрузки. Кратковременно перемешайте смесь на вортексе и быстро центрифугируйте планшет при температуре 4 °C.

Планшет с образцами подготовлен. Теперь используйте новый 96-луночный планшет для приготовления смеси для анализа в 13-кратной концентрации. Для этого в каждую лунку добавьте один универсальный праймер, прямой праймер и ген-специфический TaqMan-зонд.

Концентрации компонентов в 1X растворе составляют 1 µM для универсального и прямого праймеров и 0,2 µM для TaqMan-зонда. Затем добавьте Tween до конечной концентрации 0,25% Tween при конечном объеме в лунке 5 µL. Тщательно перемешайте, избегая образования пузырьков, и кратковременно центрифугируйте планшет для сбора жидкости.

Это планшет для анализа. Начните выполнение 96.96 Q-R-T-P-C-R с загрузки чипа. Сначала загрузите образцы, а затем реагенты для анализа с конечным объемом 5 µL на каждое входное отверстие IFC.

Затем запустите скрипт загрузки смеси, чтобы внести образцы и реагенты для анализа в чип. По завершении работы скрипта снимите защитную пленку с загруженного чипа и удалите с его поверхности частицы пыли или загрязнения с помощью адгезивной ленты. После этого настройте программу биосистемной амплификации.

Установите чип в систему и запустите программу. Результаты можно проанализировать с помощью программного обеспечения Fluid Dime для получения кривых амплификации, тепловых карт всего чипа и значений CT для каждой лунки, используя ПЦР-продукты, очищенные путем разделения по размеру на нативных полиакриламидных гелях: дикий тип DG CR eight и нуль-мутант ER.

РНК была подготовлена в соответствии с модифицированными протоколами. Благодаря этапу очистки удалось выделить большее количество микроРНК и устранить ложноположительные сигналы как на фоне делеции DGCR8, так и на фоне делеции ER. Кроме того, модифицированный подход с использованием QR TPCR R позволяет правильно категоризировать редкие Dgcr8-независимые, но Dicer-зависимые малые РНК.

В данной работе было проведено исследование 48 образцов серебра (cera) от пациентов и контрольной группы для анализа изменения экспрессии 384 различных микроРНК. Данные для каждого образца были нормализованы путем вычитания соответствующей медианы без использования внутреннего стандарта (spike-in) в контрольных образцах. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как мультиплексная Q-R-T-P-C-R на платформе flu line может быть использована для одновременного профилирования сотен микроРНК в большом количестве образцов, даже при очень ограниченном количестве исходной РНК.