Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы эффективно, недорого и с минимальным исходным материалом профилировать экспрессию микроРНК путем комбинации мультиплексного количественного R-T-P-C-R с микрофлюидной платформой. Это начинается с концентрации экстрагированной РНК, за которой следует мультиплексная обратная транскрипция и мультиплексная предварительная амплификация. Следующим шагом является очистка от излишков грунтовки.

Наконец, экспрессию одиночной микроРНК профилируют с помощью микрофлюидной платформы. Результатом являются точные и высоковоспроизводимые уровни экспрессии микроРНК в интересующих образцах. Основное преимущество данной методики из существующих методов заключается в том, что дополнительная стадия очистки после предварительной амплификации ЭМИ повышает точность и воспроизводимость мультиплексного метода Q-R-T-P-C-R.

Начните с РНК, извлеченной из сыворотки. Используя набор для очистки РНК или метод РНК на основе фенола хлороформа из гомогенизированной ткани, такой как триол, все экстракции должны быть проведены с этапом промывки, а все хранение осуществляется при температуре минус 80 градусов Цельсия. Сконцентрируйте раствор РНК.

Если вы начинаете с ограниченного количества образца, например, сначала из сыворотки, вставьте резервуар для образца MicroCon в пробирку, затем пипетируйте раствор РНК в резервуар, стараясь очень осторожно не касаться мембраны наконечником пипетки. Теперь поместите флакон и фильтр в центрифугу крэк-лентой по направлению к ротору и запустите центрифугирование в течение примерно трех часов. Через три часа РНК будет полностью сконцентрирована на мембране, чтобы вымыть РНК.

Добавьте нужное количество свободной РНК воды в мембрану, переверните резервуар и поместите в новую пробирку. Затем вращайте в течение трех минут при температуре 4 градуса Цельсия с максимальными 3000 разами G.Store концентрированной РНК при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока это не потребуется После проведения реакции ОТ на РНК с использованием праймеров xpl с обратной стебельной петлей, за которыми последовали от 12 до 18 циклов ПЦР. МикроРНК представлены цепями CD NA.

Это называется продуктом предварительной ПЦР. Говоря о предстоящем QPCR. Продукт для предварительной ПЦР должен быть очищен на 10% полиакриламидном геле вместе с лестницей из 10 парных оснований ДНК с 5,5 микролитрами шести x оранжевых G в сочетании с 27,5 микролитрами продукта для предварительной ПЦР.

Запустите гель при напряжении 150 вольт в течение 55-60 минут. Ромо фенол синий работает на этом геле в области 20 пар оснований. После того как гель потечет, окрасьте его кибер-золотом на 25 минут, не подвергая воздействию света и на шейкере от испачканного геля.

Вырежьте полосу продукта pre PCR от 60 до 80 пар оснований и перенесите гелевый блок на пробирки с маркировкой. Если концентрация продукта низкая, он может быть не виден, но все равно будет в геле. Теперь измельчите гелевую ленту с помощью пробирки в пробирке центрифугирования и добавьте 300 микролитров буфера TEN.

Инкубируйте буферную гелевую смесь в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия с перемешиванием. Через четыре часа переложите жидкость в новую пробирку и добавьте еще 300 микролитров буфера TEN. Инкубируйте эту смесь в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с перемешиванием.

На следующий день снова перенесите содержимое пробирки и приступайте к осаждению продукта предварительной ПЦР этанолом. Когда чип открывается из упаковки, он должен быть заправлен в течение 24 часов, а затем загружен в течение 60 минут после заправки. Начните заправку матрицы с впрыска 150 микролитров жидкости из управляющей линии в каждый из аккумуляторов на микросхеме.

Будьте осторожны, чтобы не пролить жидкость на чип или входные отверстия, иначе чип придет в негодность. Затем поместите микросхему в интегрированную жидкостную схему или контроллер IFC и запустите сценарий грунтовки контроллера. Как только программа начнется, приступайте к подготовке образцов.

Начните с подготовки предварительного образца смеси, представляющей собой комбинацию прихваточной машины, универсальной мастер-смеси и загрузочных реагентов. Затем, используя формат загрузки 96 лунок, смешайте 2,25 микролитра каждого образца с 2,75 микролитрами смеси предварительных образцов для сбора загруженной жидкости. Кратковременно сделайте вихревую и быстро центрифугируйте пластину при четырех градусах Цельсия.

Теперь планшет для образца подготовлен. Теперь используйте новую 96-луночную пластину для приготовления 13-кратной концентрации смеси для анализа. Это делается путем смешивания одного универсального праймера, прямого праймера и геноспецифического сенсорного зонда для человека в каждой скважине.

Концентрации 1 X составляют один микромоляр для универсального и прямого праймера и 0,2 микромоляра для такового зонда. Затем добавьте достаточное количество теста для получения конечной концентрации 0,25% в конечном объеме лунки в пять микролитров. Хорошо перемешайте, избегая пузырьков, и кратковременно покрутите пластину, чтобы собрать жидкость.

Это пробирная пластина. Начните 96.96 Q-R-T-P-C-R с загрузки микросхемы. Сначала загрузите образцы, а затем анализы с конечным объемом пять микролитров на вход в IFC.

Во-вторых, запустите скрипт load mix, чтобы загрузить образцы и анализы в чип. Когда скрипт будет завершен, снимите защитную пленку с загруженного чипа и удалите все частицы пыли или мусора с поверхности чипа с помощью клейкой ленты. Теперь настройте программу усиления биосистемы.

Загрузите чип в систему и запустите программу. Результаты могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения Fluid Dime для получения кривых усиления, тепловых карт всего чипа и значений ТТ для каждой из них. Хорошо используя продукты предварительной ПЦР, очищенные путем разделения по размерам на нативных полиакриламидных гелях, диком типе DG CR eight и ER null mutant.

РНК была подготовлена по сравнению с предыдущими протоколами. Больше микроРНК и потеря ложноположительных сигналов происходят как в восьми нулевых фонах DGCR, так и в нулевых фонах ER благодаря этапу очистки. Кроме того, модифицированный подход QR TPCR R позволяет правильно классифицировать редкие D gcr восемь независимых малых РНК, зависящих от кубиков.

Здесь 48 цер пациентов и контрольной группы были обследованы на изменение экспрессии 384 различных микроРНК. Данные были нормализованы для каждой выборки путем вычитания соответствующей медианы и без использования скачка в контрольной группе. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как мультиплексный Q-R-T-P-C-R на платформе линии гриппа может быть использован для одновременного профилирования сотен микроназ во многих образцах, даже если начать с очень ограниченным входом РНК.