Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

Общая цель этой процедуры заключается в определении подвижности усиленного зеленого флуоресцентного белка путем измерения frap белка в интересующей области. Это достигается путем первого пересечения вектора EGFP в культивируемых нейронах гиппокампа крыс. Далее запись Fre выполняется в исследуемом позвоночнике с помощью конфокального микроскопа Zeiss 710

Затем скорость фотообесцвечивания может быть рассчитана с помощью программного обеспечения Image J и GraphPad Prism. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают подвижность EGFP в позвоночнике из культивируемого нейрона гиппокампа с помощью конфокальной микроскопии. Этот протокол был разработан Чейзеном в сотрудничестве со мной, Рональдом Питом, а также Я, Ван Бахар Киша и старшим автором оригинальной статьи, Робертом Олом, который умер в октябре 2009 года.

Мы посвящаем это видео его памяти. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области динамики белка, такие как скорость оборота интересующего белка в интересующей области. Начните эту процедуру с культивирования эмбриональных нейронов гиппокампа крысы на 35-миллиметровом стеклянном дне, покрытом поли-де-лизином, на 16-18 день трансфективных нейронов in vitro с использованием набора для трансфекции млекопитающих Cal Foss с помощью набора для трансфекции млекопитающих с помощью технологии клонирования Cal Foss перед началом трансфекции.

Сохраните исходную питательную среду в стерильной пробирке объемом 15 миллилитров для последующего использования. Наполните каждую 35-миллиметровую миску 1,5 миллилитрами модифицированной орлиной среды DOL eco за 30 минут до трансфекции. Далее соедините 10 микрограммов P-E-G-F-P-N одной плазменной ДНК с 12,4 микролитрами двухмолярного раствора кальция и доведите общий объем до 100 микролитров стерильной водой.

Добавьте смесь ДНК по каплям до 100 микролитров двух куч буферизованного физиологического раствора. Вортексирование буфера после каждой капли добавляется. Дав окончательной смеси постоять при комнатной температуре в течение 20 минут, добавьте буферный раствор ДНК к инкубированным нейронам DMEM.

Инкубируйте нейроны при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-полутора часов. После инкубации удалите среду, содержащую фосфат кальция, из посуды для культур и промойте клетки DMEM. Повторите стирку DMEM в общей сложности три раза.

Замените среду DMEM на исходную питательную среду перед тем, как вернуть ее в инкубатор. Нейроны используются для эксперимента по гидроразрыву пласта через два-четыре дня после трансфекции. Для начала немедленно замените питательную среду в чашке со стеклянным дном 35 миллиметров раствором Prewarm Tiro.

Для эксперимента по гидроразрыву пласта используется конфокальный микроскоп Zeiss LSM seven 10. Система временного модуля Zeiss поддерживает температуру, влажность и процентное содержание углекислого газа в рабочей системе. Убедитесь, что бак для углекислого газа подключен и что бутылка с водой, которая используется для балансировки влажности, наполнена водой.

После того, как микроскоп будет настроен, найдите трансфицированный, зрелый дендрит с объективом 100x. Если трансфицированные клетки в чашке разрежены, найдите нужную клетку с целью 40x. Затем переключитесь на цель 100 раз.

Для съемки используйте пятикратный оптический зум и разрешение 2 56 на 2 56 пикселей. Изобразить короткий кусочек дендрита с несколькими шипами. Для съемки снимков используйте номинальную скорость девять, на которую уходит 0,5 секунды.

Чтобы завершить сканирование, установите отверстие на два микрометра для получения сильной флуоресценции. При съемке старайтесь использовать низкое лазерное излучение, например, один к 5%, чтобы избежать фотообесцвечивания всего изображения. Затем выберите позвоночник, представляющий интерес для данного эксперимента.

Для проведения эксперимента с обертыванием выбирают грибные колючки с диаметром головки колючек около одного микрометра. Сделайте пять контрольных изображений перед отбеливанием, затем обесцвечьте интересующий позвоночник 10 раз при номинальном 100%Лазерное излучение захватывает серию изображений сразу после отбеливания. Интервал времени должен быть скорректирован в соответствии с различными белками-мишенями и различными экспериментальными схемами.

Для этого эксперимента изображения захватываются каждую секунду в течение 15 секунд после обесцвечивания. Далее сохраните изображения для анализа данных. Откройте изображения с помощью программного обеспечения Image J, выровняйте стопку изображений с помощью инструмента выравнивания так, чтобы интересующий корешок не плавал и оставался в том же положении.

На изображении измерьте относительную интенсивность флуоресценции исследуемого позвоночника, который представляет собой трансфицированную, но необесцвеченную область. Измерьте область фона на покадровых изображениях с помощью инструмента контроля зависимости интенсивности от времени изображения J. Используйте нефлуоресцентную область, так как кривая области фона соответствует интенсивности флуоресценции с помощью однофазного экспоненциального уравнения в программном обеспечении GraphPad Prism или другом подобном программном обеспечении. Наконец, рассчитайте процент подвижной и неподвижной фракции флуоресценции. Показывать.

Вот измерения флуоресценции EGFP в позвоночнике из культивируемого нейрона гиппокампа. Область управления корешком и фон отмечены, а красной стрелкой указано время фотообесцвечивания. Фотографии одной и той же области были сделаны до и через 0, 1, 5, 10 и 15 секунд после фотообесцвечивания.

Кривые флуоресценции FRA EGFP отображаются в течение 15-секундного периода, при этом точки на кривых представляют FRA в каждую секунду. Кривые подгонялись с помощью однофазовых экспоненциальных уравнений. Средняя флуоресценция до фотообесцвечивания составила 100%В этом эксперименте подвижная фракция составила 87%, а неподвижная фракция — 13%А.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерить подвижность белка, меченного A GFP, с помощью метода FRAPPE.