Мио-механический анализ изолированных скелетных мышц

Целью этой процедуры является определение создаваемой силы и утомляемости изолированных скелетных мышц в качестве способа количественной оценки эффектов генетической модификации или терапии. Сначала из задней конечности мыши рассекается самая длинная мышца разгибателя пальцев. Затем мышца монтируется в мышечную полоску мио.

Следующим шагом является определение напряжения для стимуляции и предварительного напряжения мышцы, при котором достигается максимальное напряжение при подергивании. Заключительным этапом является определение соотношения частоты силы для мышцы, а также начала и степени усталости при низкочастотной стимуляции к танической. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают измеримые изменения в механических свойствах мышцы с помощью миографии.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как тестирование с физической нагрузкой, заключается в том, что миография позволяет количественно оценить силу и функцию мышц. Мы впервые применили этот метод, когда поняли, что необходимы количественные меры для оценки мышечной функции, поскольку новые клеточные и биоинженерные методы лечения мышечных заболеваний тестируются на доклинических моделях животных. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии мышц и мышечной дистрофии, например, изменяют ли функции мышц специфические методы лечения или генетические модификации.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку шаги, необходимые для правильной работы с мышцей, трудно освоить. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что быстрое, травматическое рассечение задних мышц требует практики и приобретенных навыков. Демонстрация процедуры будет сделана, когда мы встретимся с научным сотрудником и аспирантом в наших лабораториях.

После эвтаназии мыши разложите тушу брюшной стороной вверх на подносе для вскрытия и прикрепите ножку к лотку под микроскопом для вскрытия. Разрежьте кожицу и осторожно раскройте фасцию. Затем обнажите переднюю большеберцовую мышцу от лодыжки вверх, чтобы обнажить длинный разгибатель пальца или мышцу EDL.

Используйте капли раствора лактатного рингера, чтобы сохранить мышцы влажными во время сбора урожая. Затем рассеките EDL, сохранив как можно больше сухожилий на каждом конце, и стараясь не касаться самих мышечных волокон EDL. Поместите мышцу EDL в чашку Петри, содержащую раствор лактата Рингера.

Теперь завяжите швы на каждое из мышечных сухожилий. В этих исследованиях используется тканевая ванна для удержания мышцы и датчик силы для измерения мышечного напряжения. Кроме того, электрический стимулятор с квадратным импульсом и платформа сбора данных используются для извлечения, записи и анализа моих механических реакций.

Следующим шагом является заполнение ванны для миографта 6,5 миллилитрами препарата Кребса, отсюда и спутниковое решение. Нагрейте ванну до 25 градусов Цельсия в пузыре раствор Кребса с 95% кислорода, 5% углекислого газа после бурления в течение 15 минут. Используйте швы на сухожилиях, чтобы перенести мышцу EDL в ванну.

Закрепите сухожилия между зажимами миотрансплантата. Будьте осторожны, чтобы не зажать саму мышцу. Поддерживайте ванну для миотрансплантата при температуре 25 градусов по Цельсию.

Чтобы начать анализ напряжения, отрегулируйте начальную длину мышцы так, чтобы она была равна длине мышцы инси. С помощью стимула длительность 0,5 миллисекунды. Постепенно увеличивайте напряжение, чтобы определить стимул, необходимый для получения максимального напряжения подергивания.

Затем установите стимул на 20% выше, чтобы достичь сверхмаксимального стимула, который обычно составляет около 40 вольт. Следующим шагом является постепенное растяжение мышцы до тех пор, пока напряжение подергиваний не прекратится. Такая длина считается оптимальной длиной мышц.

Дайте мышце уравновеситься в течение трех минут, затем удерживайте мышцу на оптимальной длине. Подайте сверхмаксимальный квадратный стимул и запишите выход, запишите кривую напряжения подергивания. На этом рисунке.

Максимальное напряжение подергивания обозначается как pt. Время сокращения обозначается как ct. Время полурасслабления обозначается как ЗГТ.

Столбец обозначает одну секунду после трехминутного периода отдыха. Измерьте напряжение «Титаника», применяя напряжение сверхмаксимальных стимулов в течение 300 миллисекунд с частотой 150 герц при оптимальной длине. Эта процедура создает кривую напряжения столбняка.

Максимальное напряжение «Титаника» обозначено как po. Полурелаксатор Titanic Tension имеет маркировку HRTT. Столбец обозначает одну секунду после трехминутного периода отдыха.

Начните частотно-силовой анализ с применения 300-миллисекундных последовательностей сверхмаксимальных стимулов с частотой тридцать шестьдесят сто, сто сорок и 160 герц. Дайте три минуты отдыха между каждой серией стимулов после трехминутного периода отдыха. Начните анализ усталости с подачи коротких последовательностей таай 60 герц в течение 300 миллисекунд каждые три секунды в течение 10 минут на 10 минут.

Титаническая сила должна снизиться до уровня плато около 15% от первоначального значения. Закончив запись силы с мышцей на оптимальной длине, измерьте диаметр мышцы с помощью окуляра на микроскопе. После этого снимите швы и взвесьте мышцу, чтобы определить мышечную массу.

Последним шагом является взвешивание мыши, чтобы оценить массу тела. Эти измерения используются для расчетов, перечисленных в сопроводительной статье. На этом рисунке показано увеличение напряжения, возникающего с увеличением частоты раздражителей.

Вот реакция мышц на импульсный поток на частоте 30 герц. На этом рисунке показана большая сила, возникающая при последовательности импульсов в 140 Гц. На этом графике показано соотношение частот силы, представленное в виде процента максимальной силы по отношению к частоте стимуляции.

Форма кривой частоты силы характерна для мышечной силы и может быть использована для сравнения мышц разных животных. Этот показатель демонстрирует мышечную усталость в течение 10 минут низкочастотной стимуляции. Эти цифры показывают реакцию мышцы на поезд стимулов в указанные временные точки.

Этот график показывает низкочастотную мышечную усталость в виде плюса от максимальной силы в зависимости от времени. Форма низкочастотной кривой усталости характерна для мышечной силы и может быть использована для сравнения мышц разных животных. После освоения этой техники ее можно сделать за 30 минут после этой процедуры.

Другие методы, такие как иммуногистохимия, вестерн-блоттинг и количественная ПЦР, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, экспрессируются ли специфические миогенные белки и маркеры стволовых клеток в обработанной мышце во время этой процедуры. Важно помнить, что все оборудование должно быть наготове, чтобы свести к минимуму время между сбором мышечной массы и анализом. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как рассекать мышцу задней конечности, монтировать мышцу в мышечную полоску мио, такую как та, которую мы вам показали по датской технологии мио и измерять изменения своих механических свойств.