Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Целью данного эксперимента является наблюдение за развитием in vivo отдельных клеток переднего мозга, нервных клеток-предшественников с помощью покадровой визуализации эмбрионов рыбок данио-рерио в режиме реального времени. Это достигается путем электропорации конструкций ДНК, кодирующих флуоресцентные маркеры, которые помечают редко расположенные четыре нейронные клетки-предшественника мозга. Электропорированные эмбрионы обезболивают, устанавливают в арос с низкой температурой плавления и визуализируют с помощью покадровой конфокальной микроскопии.

Результаты показывают развитие in vivo определенной нервной клетки-предшественника переднего мозга. Этот метод может дать представление о развитии InVivo нейропрогенных клеток foin. Он также может применяться к другим областям центральной нервной системы, таким как мембрана, hein и спинной мозг.

Основное преимущество этого метода или существующих методов, таких как инъекция ДНК или РНК на стадии одной клетки, заключается в том, что они нацелены именно на собственные интересы в любой момент времени. Этот протокол начинается за день до плановой электропорации. Утром соберите 50 оплодотворенных эмбрионов от спаренных рыб данио, искупайте эмбрионы в эмбриональной среде, содержащей фенилтреа или ПТУ, инкубируйте погруженные эмбрионы в течение 22 часов при температуре 28,5 градусов Цельсия на следующий день.

Через 22 часа после оплодотворения эмбрионы готовы к электропорации. Начните с ручного покрытия эмбрионов тонкими щипцами. Перенесите покрытые оболочкой эмбрионы в 10 миллилитров раствора электропоратора, содержащего ПТУ, чтобы затем обезболить эмбрионы.

На 420 мкл Трика запас в концентрации четыре миллиграмм на миллилитр к раствору. Теперь эмбрионы готовы к электропорации, чтобы подготовить инъекционные иглы, необходимые для электропорации. Стеклянные капилляры вытягиваются и их кончики разбиваются щипцами, чтобы получить резкую низкую температуру плавления 0,2.

Также необходимы агрорешения, которые включают в себя 1%-ный раствор, суспендированный в электропораторах, и 0,8%-ный раствор в эмбриональной среде для монтажа. Поместите два разных агрораствора в две миллилитровые микроцентрифужные пробирки и держите их наготове в нагревательном блоке при температуре около 37 градусов Цельсия. Этот протокол использует систему GAL four UAS для управления экспрессией генов в нейронных клетках-предшественниках.

Две плазмиды используются, когда повсеместно экспрессирует GAL four ff, а другая экспрессирует GFP в ответ на GAL four ff. Обе плазмиды подготавливают наборами для использования приготовленных, концентрируя их до одного-двух микрограммов на микролитр с использованием осаждения этанола ацетата натрия в растворе 10 миллимолярных Tri cl. После определения концентрации плазмид разведите обе плазмиды в одном растворе с водой, не содержащей нуклеаз, до 500 нанограмм на микролитр.

При такой концентрации они будут оцениваться вместе, чтобы визуализировать подачу раствора, окрашивать его феноловым красным на 10% от общего объема раствора. Теперь раствор готов к электропорации и должен быть помещен на лед. Электропорационная установка состоит из стереодиссекционного микроскопа с максимальным увеличением 50 раз.

Установка оснащена инжектором давления воздуха, двумя микрометровыми манипуляторами и электрическим стимулятором. Электрод на левом микроманипуляторе имеет специальные платиново-иридиевые параллельные биполярные электроды прямо перед электропорацией обратно загружают инъекционную иглу двумя микролитрами раствора ДНК и регулируют объем инъекции до четырех нанолитров. С этого момента протокол требует практики для идеального монтажа, погружения и немедленного удаления двух эмбрионов из агрораствора с низкой температурой плавления 1%.

С помощью стеклянной пипетки переложите каждому по своей капле агрос на платформу или в миску в каплю. Используйте волокнистый щуп, чтобы аккуратно ориентировать эмбрионы в положение дорсально вверх, прежде чем агро затвердеет. Это сделает передний мозг доступным как для электродов, так и для иглы для микроинъекций.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все 10 капель не будут загружены всеми подготовленными эмбрионами. Вставьте электроды в аэрос и введите иглу для микроинъекций в желудочек переднего мозга. Теперь введите четыре нанолитра смеси ДНК.

Обратите внимание на кровоток и следите за отеком желудочка. Как только будет замечен отек, подайте два из 4 27 импульсов по 0,5 вольта длительностью, по одной миллисекунде каждый. Эти четыре импульса должны быть поданы в противоположной полярности.

Результатом является двусторонняя мозаичная маркировка четырех нейронных клеток-предшественников мозга. Теперь извлеките иглу для инъекции из переднего мозга и переместите стадию к следующему эмбриону. Повторите процесс инъекции и электропорации на каждом оставшемся эмбрионе.

После того, как все 10 эмбрионов будут подвергнуты электропоре, залейте эмбрионы пятью миллилитрами эмбриональной среды, чтобы перенести эмбрионы. Очистите арос микрохирургическим ножом и переместите их в свежую посуду, содержащую 30 миллилитров эмбриональной среды. Перед визуализацией инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение примерно четырех часов, четырех часов после электропорации.

Сигнал EGFP является наблюдаемым. При просмотре под эпифлуоресцентным препарирующим микроскопом через час или пять часов после электропорации выберите эмбрионы с высокой мозаичной, но сильной экспрессией EGFP в области четырех головного мозга. Перенесите выбранные эмбрионы в 10 миллилитров среды и обезболите их добавлением 420 микролитров трика бульона в концентрации четыре миллиграмм на миллилитр.

Визуализация будет производиться на предметном столике с контролируемой температурой конфокального микроскопа, оснащенного вертикальными объективами. Подготовил прицел, установив температуру предметного столика на уровне 28,5 градусов по Цельсию. Также разогрейте эмбриональную среду до 28,5 градусов Цельсия.

Чтобы поместить эмбрион, с помощью стеклянной пипетки ненадолго погрузите его в арос и поместите в центр чашки для культуры со стеклянным дном толщиной 35 миллиметров. С помощью волокнистого щупа аккуратно расположите эмбрионы в положение спины вверх до того, как агро застынет, и накройте их тремя миллилитрами предварительно подогретой среды. Теперь эмбрион готов к покадровой съемке в реальном времени с фиксированным интервалом времени с целью погружения в воду. Здесь представлены конфокальные изображения одной нервной клетки-предшественника.

Используя этот метод, мы можем наблюдать, как эта клетка мигрирует и делится дважды между 28,5 и 41,5 часами после оплодотворения. Минимизируя мощность лазера и пополняя запасы эмбриона, медиаизображения можно продолжать делать в течение 60 часов после оплодотворения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить электропорацию к генетически помеченным и видеонейропрогенным клеткам и как обращаться с эмбрионами с электродами.

Для конфокальной визуализации на уровне TimeLapse, после освоения, эта электропорация может быть выполнена менее чем за один час, если она выполнена правильно.