Finger-палки забора крови Методология определения Упражнение вызванных лимфоцитов Апоптоз
24 февраля 2011 г.
Физические упражнения способны индуцировать апоптоз клеток иммунной системы. Существуют различные ограничения измерения, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до проведения оценки. Продемонстрированный является быстрым и минимально инвазивные процедуры для анализа упражнения-индуцированного апоптоза лимфоцитов.
Здравствуйте, меня зовут Джеймс Вольта, я учусь в программе «Наука о физических упражнениях» на кафедре кинезиологии, отдыха и спорта в Университете Западного Кентукки. И что мы собираемся сделать, так это показать вам процедуру, которую мы разработали, и процедуру, которую мы используем для измерения физических упражнений в показателях лимфоцитов, апоптоза. Итак, давайте посмотрим.
Образец крови из пальца берется с использованием универсальных мер предосторожности: капли пальца. Подушечку пальца стерилизуют, затем прокалывают. Первая капля крови вытирается, а затем кровь набирается в капиллярные трубки или микроложа.
10 микролитров цельной крови пипетируются в антителенную панель, содержащую проточную цитометрию, стоячий буфер соответствующих флуорохромов, включая добавку и V семь аминоактина D, либо CD 4, либо CD 8, либо CD 19 и CD 45 ra В дополнение к пробирке только для клеток, мы использовали компенсационные бусины в качестве контроля, чтобы помочь организовать наши эксперименты. Образец тщательно перемешивают в вихре и затем дают инкубироваться комнатной температуры в темноте в течение 30 минут. После инкубации образцы центрифугируются в течение 10 минут, а затем образцы декантируются одним плавным движением.
В него добавляют 300 микролитров буфера для лизиса эритроцитов, и образцы тщательно обрабатывают. Очень важно, чтобы образец и буфер для лизиса были тщательно перемешаны. Чтобы облегчить максимальное удаление эритроцитов, вы заметите, что ваш образец начинает мутнеть.
Но по крайней мере через 15 минут инкубации при комнатной температуре он очистится, так как эритроциты являются Ls, добавляется 300 микролитров фосфатно-солевого буфера, действующего как стоп-раствор для прекращения реакции лизиса. И образцы снова центрифугируются в течение 10 минут. Обратите внимание, что после процедуры центрирования на дне пробирки одним плавным движением будет сцежено несколько клеток, тщательно сцеживающих вихрь для ресуспензии клеток и раствора.
И ваш образец готов к анализу с помощью проточной цитометрии. Здесь мы показываем репрезентативные прямые внутренние диаграммы рассеяния, стробирующие в субфракции лимфоцитов, и идентификацию анекс и V-положительных клеток в подмножестве. Итак, мы только что описали методологию, которую мы используем для определения птоза лимфоцитов, вызванного физической нагрузкой, и мы думаем, что есть много других применений, которые можно использовать с этой методологией.
Его действительно можно использовать для изучения любого типа белых кровяных телец, кроме лимфоцитов и субфракции лимфоцитов. И его также можно использовать для измерения любого маркера, который находится на внешней стороне клетки. Так что мы действительно думаем, что это имеет более широкое применение.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен экспресс-метод минимально инвазивного анализа апоптоза лимфоцитов, индуцированного физической нагрузкой. Работа освещает влияние физических упражнений на апоптоз иммунных клеток и рассматривает ограничения измерений, связанные с обработкой образцов крови.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Наука об упражнениях
- Иммунология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Физические нагрузки могут индуцировать апоптоз в иммунных клетках.
- Традиционные методы обработки образцов крови имеют определенные ограничения при проведении измерений.
- Для проведения эффективного анализа необходимы методы экспресс-оценки.
- Понимание механизмов апоптоза лимфоцитов имеет решающее значение для изучения иммунного ответа.
Цель исследования
- Разработать методику измерения апоптоза лимфоцитов, индуцированного физической нагрузкой.
- Минимизировать время, необходимое для выделения и обработки образцов крови.
- Повысить точность измерения апоптоза в иммунных клетках.
Используемые методы
- Забор образцов крови из пальца с соблюдением универсальных мер предосторожности.
- Сбор крови в капиллярные трубки или микрокюветы.
- Удаление первой капли крови для обеспечения чистоты образца.
- Быстрая обработка для оценки апоптоза лимфоцитов после физической нагрузки.
Основные результаты
- Продемонстрирован успешный метод анализа апоптоза лимфоцитов.
- Показано, что физические нагрузки оказывают значительное влияние на апоптоз иммунных клеток.
- Устранены ограничения, присущие предыдущим методам измерения.
- Создана основа для будущих исследований в области иммунологии физических упражнений.
Выводы
- Разработанная процедура эффективна для экспресс-анализа апоптоза лимфоцитов.
- Физические нагрузки оказывают измеримое влияние на динамику иммунных клеток.
- Данный метод может способствовать дальнейшим исследованиям в области влияния физических нагрузок на иммунный ответ.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Быстрая оценка индуцированного физическими нагрузками апоптоза лимфоцитов решает одну из ключевых проблем иммунологических исследований: дифференциацию истинных биологических эффектов от артефактов, возникающих из-за задержки при обработке образцов. Данная методика позволяет более точно измерять динамику иммунных клеток, что способствует валидации мишеней в физиологии упражнений и иммунофармакологии. Минимизация времени обработки и объема образцов повышает достоверность данных для изучения механизмов иммуномодуляции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать физическую нагрузку как физиологический стимул апоптоза иммунных клеток, что способствует проверке целевых гипотез в иммунологии.
- Операционная ценность: сокращает время обработки образцов с часов до минут, позволяя проводить оценку путей гибели лимфоцитов в режиме реального времени.
- Прогностическая ценность: обеспечивает количественные показатели аннексина V и 7-AAD для оценки апоптоза в субпопуляциях лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD19+).
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Цельная кровь добавляется непосредственно в панели антител сразу после сбора, что позволяет сохранить нативное состояние клеток для анализа методом проточной цитометрии.
- Воспроизводимость: Стандартизированные этапы инкубации (30 мин, при комнатной температуре, в темноте) и лизиса обеспечивают стабильное выделение лимфоцитов и детекцию апоптоза.
- Масштабируемость: Забор крови из пальца позволяет сократить объем образца до 10 µL, что делает возможным частый лонгитюдный мониторинг в доклинических или клинических исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Поддерживает исследования в области иммунологии физических упражнений, связывая физический стресс с апоптозом лимфоцитов через измеримые биомаркеры.
- Снижение механистических рисков: Позволяет изолировать индуцированный физическими упражнениями апоптоз от артефактов ex vivo, повышая достоверность исследований по взаимодействию с мишенью.
- Релевантная системная модель заболевания: Применима к моделям иммуномодуляции, в которых в качестве вмешательства используются физические упражнения или их миметики.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в непрерывный процесс исследований от проверки гипотез до валидации мишеней, особенно в программах по иммунологии и физиологии упражнений, где гибель иммунных клеток служит механистическим показателем.
- Биологические исследования: Обеспечивают функциональную валидацию апоптоза лимфоцитов в качестве биомаркера иммунного ответа на физиологические стрессоры.
- Скрининг: Позволяет получать стандартизированные количественные данные проточной цитометрии для сравнения уровней апоптоза при различных условиях или генотипах.
- Аналитика: Обеспечивает применение стратегий гейтирования для количественного определения annexin V+ лимфоцитов в субфракциях CD4+, CD8+ и CD19+.
- Трансляционные исследования: Связывают эффекты острой физической нагрузки с динамикой иммунных клеток, что помогает при выборе биомаркеров для доклинических моделей.
- Применимость в других проектах: Панель антител и протокол лизиса могут быть адаптированы для анализа других иммунных маркеров или типов клеток, помимо лимфоцитов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неоднозначность в анализах апоптоза за счет минимизации преаналитических переменных.
- Операционная ценность: Стандартизирует работу с образцами при минимальных требованиях к обучению и совместимости с методами анализа в месте оказания медицинской помощи.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки в иммунологических программах за счет предоставления надежных специфических данных об апоптозе.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию иммуномодулирующих соединений или миметиков физических упражнений с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии и разработки панелей антител для иммунофенотипирования лимфоцитов.
- Необходим доступ к центрифугированию, вортексу и реагентам для лизиса эритроцитов.
- Требуется стандартизация времени инкубации и защиты от света для всех пользователей и центров.
- Необходимо учитывать вариабельность качества образцов, полученных путем прокола пальца, и выхода лейкоцитов.
- Метод ограничен поверхностными и внутриклеточными маркерами, совместимыми с этапами фиксации/лизиса; не подходит для лабильных сигнальных белков.
