Нейромодуляция и митохондриальной Транспорт: Live изображений в нейронах гиппокампа в течение длительного времени

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации митохондриального транспорта и культивируемых нейронов в течение длительного времени с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Это достигается путем предварительного мечения митохондрий в культивируемых нейронах флуоресцентным белком, нацеленным на орган L. Вторым этапом процедуры является получение изображений митохондриального транспорта в контролируемых условиях.

Третьим этапом процедуры является получение серии покадровых изображений митохондриального транспорта после интенсивного введения нейромодуляторов, таких как серотонин. Заключительным этапом процедуры является выполнение анализа полученного ряда покадровых изображений. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают, что нейротрансмиттеры модулируют митохондриальный транспорт.

Такие результаты достигаются только путем визуализации флуоресцентно меченых митохондрий в нейронах в течение длительного времени. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как мечение жизненно важным красителем или транзиторная трансфекция GFP, заключается в том, что этот метод позволяет проводить долгосрочные наблюдения за митохондриальным транспортом в здоровых культивируемых нейронах. Эту процедуру будет демонстрировать Чен, младший научный сотрудник моей лаборатории, чтобы обеспечить стабильно отапливаемую и увлажненную среду.

Верхний инкубатор stage соединен со стандартным инкубатором для тканевых культур по замкнутой схеме, мембранная крышка A-P-F-T-E для стекла 35 миллиметрового стекла обеспечивает газообмен между культурой нейронов и окружающей средой внутри инкубатора. В совокупности эти и другие особенности позволяют проводить долгосрочные наблюдения за культивируемыми нейронами в различных экспериментальных условиях. Перенесите культуральную чашку, содержащую культивируемые нейроны гиппокампа, экспрессирующие красный белок мито турбо, в капюшон для культуры тканей.

Замените пластиковую крышку на мембранную крышку PFTE и переместите чашку для культур в микроскоп. Прикрепите основание инкубатора к предметному столику микроскопа, а затем аккуратно усадите на пленку накрытую культурой чашку. В утопленном отверстии совместите корпус инкубатора со стальными стойками на основании инкубатора и опустите корпус на основание.

Затяните винты с накатанной головкой до тех пор, пока не будет достигнуто хорошее уплотнение между корпусом и основанием. Перед открытием программного обеспечения для обработки изображений включите контроллер колеса фильтра микроскопа, источник света и ПЗС-камеру. В этом протоколе для получения изображений используется пятый слайдбук.

Переключитесь на 63-кратный масляный иммерсионный объектив и опустите башню с объективом. Осторожно нанесите иммерсионное масло на поверхность объектива. Нажмите на значок окна фокусировки на панели инструментов и включите индикатор яркого поля, перемещая ползунок индикатора.

Чтобы отрегулировать интенсивность света, приобретите фокус на поле клеток с помощью окуляра и найдите интересующую клетку. Выберите фильтр XI 3 на вкладке области с помощью окуляров, найдите плоскость фокусировки для митохондрий в клетках, которые были помечены красным белком mito turbo, а затем переключитесь на ПЗС-камеру. Нажмите на значок захвата изображения на панели инструментов, начиная с начального времени экспозиции 100 миллисекунд.

Найдите оптимальную экспозицию с помощью теста и найдите лучшие кнопки в окне съемки. В поле типа захвата. Установите флажок «Интервальная съемка» и выберите нужный интервал и продолжительность сеанса съемки в разделе «Параметры цейтраферной съемки».

Начните съемку покадрового изображения, нажав кнопку «Пуск» в нижней правой части окна съемки. После захвата сеанса контрольной визуализации введите нейротрансмиттеры или другие реагенты через отверстия для инъекций в верхней части инкубатора stage top. При добавлении агониста серотониновых рецепторов восемь O-H-D-P-A-T-A ранее неподвижных митохондрий, обозначенных стрелкой, перемещаются по аксону нейрона гиппокампа.

Средняя скорость и направленность отдельных митохондрий суммируются до добавления серотонина. Большинство митохондрий неподвижны, однако после добавления серотонина 42% митохондрий теперь демонстрируют направленное движение и перемещаются на большие расстояния, чем те, которые демонстрируют направленное движение в отсутствие серотонина. И наоборот, при добавлении дофамина 92% митохондрий остаются неподвижными к последним 15 минутам сеанса визуализации после этой процедуры.

Другие методы мониторинга более одного сигнала могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, как связаны активность кальция и транспорт митохондрий в нейронах.