Обнаружение сигнализации эффектор-Комплексы Вниз по течению от BMP4 Использование На месте НОАК, Пробирной Расстояние Лигирование

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации и количественной оценке сигналинга BMP в клетках тканевой культуры. BMP связываются с рецепторами на поверхности клетки и фосфорилируют три эффектора Smad: Smad1, Smad5 и Smad8. Последние образуют комплексы с Smad4 и перемещаются в ядро, где регулируют транскрипцию.

В данной работе мы используем метод PLA для визуализации комплексов, образующихся между эндогенными эффекторами SMA и smad four в культурах клеток с BMP-стимуляцией или без нее. Процедура начинается с параллельного применения двух первичных антител: одно из них распознает все три фосфорилированных эффектора smma, а другое — smad four. Затем вторичные антитела, называемые PLA-зондами, каждый из которых содержит уникальную короткую цепочку ДНК, связываются с первичными антителами; при этом PLA-зонды должны находиться в непосредственной близости друг от друга. Цепочки ДНК взаимодействуют после последующего добавления двух ДНК-олигонуклеотидов, формирующих кольцо.

Эти фрагменты соединяются путем ферментативного лигирования, образуя кольцо, которое после реакции амплификации размножается посредством катящегося кольца (rolling circle replication). Гибридизация меченых комплементарных олигонуклеотидных зондов позволяет визуализировать флуоресцентные пятна продукта, связанные с амплификацией каждого кольцевого продукта ДНК, которые легко определить.

При просмотре под флуоресцентным микроскопом точки соответствуют комплексам эффектора, seds и smad four, что свидетельствует об активном BMP-сигналинге в клетке. Основными преимуществами PLA перед существующими методами являются простота использования, высокая чувствительность и отсутствие фонового сигнала, а также возможность количественной оценки активного BMP-сигналинга in situ. Путь BMP имеет важное значение для развития нескольких органов и тканей, а также для таких процессов, как пролиферация и дифференцировка стволовых клеток.

Метод PLA может быть использован для решения ключевых вопросов, касающихся динамики, уровней и субклеточной локализации BMP-сигналинга, а также может применяться в диагностике. Поскольку данный путь лежит в основе ряда заболеваний, BLA можно использовать для изучения других компонентов передачи сигнала BMP или других путей, а также адаптировать для работы с срезами тканей или целыми эмбрионами. Для начала проведения анализа лигации вблизи in situ подготовьте клеточные культуры: клетки Neuro 2A культивируют в среде GMEM с добавлением 10% FBS, 1× незаменимых аминокислот, 1× пирувата и 1× L-глутамина.

Рассейте клетки с помощью трипсина, высевая по 15 000–20 000 клеток на лунку. В 16-луночной камерной стекле инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% carbon dioxide в течение 24 часов. По прошествии 24 часов.

Замените культуральную среду на дополненную безсывороточную среду GMEM и инкубируйте контроли еще два-три часа. Три лунки с клетками оставьте в обычных условиях культивирования после второй инкубации. Ингибируйте путь BMP, обработав клетки 2 µM дорсаморфина, или индуцируйте сигналинг, обработав клетки BMP 4 в течение 10–60 минут.

После стимуляции клеток аспирируйте среду из лунок и осторожно промойте клетки раствором PBS, чтобы избежать их отсоединения. Не вносите PBS с помощью пипетки непосредственно на клетки. Затем аспирируйте PBS и снимите камеры, оставив силикон вокруг лунок.

Добавьте в лунки 50 µL свежеприготовленного и отфильтрованного 4% параформальдегида и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания. После фиксации промойте клетки PBS в течение пяти минут при комнатной температуре с перемешиванием в копин-джаре. Повторите промывку дважды, чтобы в общей сложности было три промывки.

Затем сделайте клетки проницаемыми, используя 0,5% Triton X 100 в PBS в стакане для окрашивания, и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания. После этого промойте клетки 0,05% tween 20 и TBS 3 раза по пять минут за одну промывку с перемешиванием в стакане для окрашивания. Начните процедуру блокировки, аккуратно постучав по предметному стеклу, чтобы удалить остатки последнего промывочного раствора.

Следите за тем, чтобы клетки не пересыхали. Добавьте по одной капле DUO link в блокирующий раствор в каждую лунку. Инкубируйте клетки в блокирующем растворе в течение 30 минут при 37 °C в предварительно нагретой увлажненной камере, представляющей собой пустую коробку для наконечников с дистиллированной водой.

Для приготовления растворов первичных антител разведите anti phospho smad 1 5 8 и anti SMAD four one в соотношении 1:100 в разбавителе для двух антител duo link. Используйте каждое антитело по отдельности и в комбинации. Теперь аккуратно постучите по предметному стеклу, чтобы удалить блокирующий раствор, и добавьте по 40 µL растворов антител в соответствующие лунки; в качестве отрицательного контроля можно добавить только разбавитель.

Выполните этот этап быстро, чтобы клетки не пересохли. Теперь инкубируйте предметные стекла при 37 °C в предварительно нагретой увлажненной камере в течение одного часа. Во время инкубации разведите два PLA-зонда в разбавителе.

Для каждой реакционной смеси смешайте 8 µL каждого зонда и 24 µL разбавителя, чтобы развести зонды в растворе в соотношении 1:5. После одного часа инкубации слейте раствор первичных антител и дважды промойте стекла буфером DuoLink Wash Buffer A по пять минут каждое при комнатной температуре с перемешиванием в специальном стакане. По завершении промывок слейте остатки буфера Wash Buffer A со стекол и добавьте по 40 µL раствора PLA-зондов на каждое из них.

Теперь инкубируйте предметные стекла при 37 °C в предварительно нагретой увлажненной камере. В течение одного часа подготовьте раствор для лигирования из стока DuoLink ligation stock, предварительно перемешав сток на вортексе и разведя его в высокочистой воде до концентрации 1x.

Учтите, что фермент лигаза добавляется в данный раствор в разведении 1:40, при этом на одну лунку требуется 40 µL смеси. После инкубации слейте раствор ПЛА-зондов со стекол и дважды промойте их буфером для промывки (Wash Buffer). В течение пяти минут при комнатной температуре с перемешиванием в стакане для окрашивания при последней промывке извлеките Duo link Ligase из охлаждающего блока, затем добавьте его в раствор для лигирования до конечного разведения 1:40 и перемешайте на вортексе.

Теперь слейте остатки промывочного буфера А со слайдов и добавьте 40 µL смеси для лигирования. Перемешайте смесь с ферментом на каждом слайде. Инкубируйте слайды в предварительно нагретой увлажненной камере в течение 30 минут.

Разморозьте исходный раствор для амплификации DUO link при 37 °C и подготовьте его к этапу амплификации во время инкубации, разбавив исходный раствор для амплификации DUO Link в воде высокой степени очистки до концентрации 1x. Храните реагенты в защищенном от света месте, так как они светочувствительны. После завершения этапа лигирования слейте раствор и дважды промойте стекла буфером для промывки Wash Buffer A по две минуты каждое при комнатной температуре с перемешиванием в стакане для окрашивания; во время последней промывки добавьте полимеразу DUO link в раствор для амплификации до конечного разведения 1:280 и перемешайте на вортексе. После слива буфера для промывки добавьте по 40 µL смеси для амплификации в каждую лунку и инкубируйте стекла в предварительно нагретой темной влажной камере в течение 100 минут при 37 °C.

По завершении инкубации для амплификации слейте раствор полимеразы со слайдов и промойте их в промывочном буфере B дважды по 10 минут за одну промывку, используя при этом coupling jar; на этом этапе держите слайды в темноте, так как реагенты чувствительны к свету. После двух промывок погрузите слайды в 0,1-кратный раствор промывочного буфера B. Теперь полностью удалите силикон со слайда на 16 лунок, затем добавьте примерно 40 µL соответствующего раствора.

Нанесите смолу для заключания образцов на покровное стекло и аккуратно поместите его поверх образцов, слегка нажав, чтобы под покровным стеклом не осталось пузырьков воздуха; зафиксируйте и загерметизируйте покровное стекло на предметном стекле с помощью лака для ногтей, выдержав интервал не менее 15 минут перед визуализацией. На данных снимках, полученных с помощью конфокального микроскопа, представлены клетки, которые обрабатывали 2 µM дорзоморфина, ингибитора пути BMP, или 25 ng/mL BMP4 в течение 60 минут.

Для обнаружения активных комплексов Smad использовали антитела к Phospho Smad 1 58 и Smad four, которые видны в виде красных точек. Ядра клеток окрашены в синий цвет с помощью dpi. Сигналы PLA подсчитывали с использованием программного обеспечения DUO link image tool; среднее количество точек в ядре на одну клетку представлено на графике.

Окрашивание не наблюдается при использовании каждого из первичных антител по отдельности, что указывает на отсутствие фонового связывания PLA-зондов и последующей лигирования олигонуклеотидов. Аналогичным образом, пятна не обнаруживаются в другом отрицательном контроле, где отсутствуют оба первичных антитела. Вестерн-блоттинг клеток Neuro 2A выявляет фосфорилированные белки SMAD 1, 5 и 8 как в необработанных, так и в клетках, обработанных BMP.

Однако уровни phospho smad заметно снижены в клетках, обработанных дорсальным морфином. Антитело к PCNA служит контролем загрузки. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как следовать шагам и настройкам, которые мы предлагаем, чтобы получить результаты менее чем через шесть часов после фиксации клеток.

Таким образом, этапы включают блокировку, инкубацию с первичными антителами, инкубацию с ПЛА-зондами, амплификацию путем лигирования, монтирование и визуализацию.