Обнаружение сигнализации эффектор-Комплексы Вниз по течению от BMP4 Использование На месте НОАК, Пробирной Расстояние Лигирование

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации и количественном определении передачи сигналов BMP в клетках тканевой культуры. BMP связываются с рецепторами на поверхности клетки и фосфатируют три, smad эффекторы, smad один, smad 5 и SMAD 8. Они образуют комплексы с smad four и перемещаются в ядро, где организуют транскрипцию.

Здесь мы используем PLA для визуализации комплексов, формирующихся между эндогенными эффекторами SMA и smad four в клетках тканевой культуры со стимуляцией BMP или без нее. Это начинается с параллельного использования двух первичных антител, одно из которых распознает все три фосфорилированных, smma, эффекторов, а другое распознает четыре вторичных антитела, называемых зондами PLA, каждое из которых имеет уникальную короткую цепь ДНК, прикрепленную к ней, связывающихся с первичными антителами там, где зонды PLA находятся в непосредственной близости. Нити ДНК взаимодействуют посредством последующего добавления двух кругов, образующих ДНК-олигонуклеотиды.

Они соединяются вместе с помощью ферментативного лигирования и образуют круг, который усиливается за счет репликации вращающегося круга после реакции амплификации. Гибридизация меченых комплементарных олигонуклеотидных зондов выделяет флуоресцентные пятна продукта, связанные с амплификацией каждого циркуляризованного. Продукты ДНК хорошо видны.

При рассмотрении под флуоресцентным микроскопом пятна соответствуют комплексам между эффектором, seds и smad four, что указывает на активную передачу сигналов BMP в клетке. Основные преимущества PLA перед существующими методами заключаются в том, что он прост в использовании, обладает высокой чувствительностью и не требует фона, а также может быть использован для количественной оценки активной сигнализации BMP in situ. Путь BMP необходим для развития нескольких органов и тканей, а также для процессов, включая пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток.

PLA может быть использован для решения ключевых вопросов, касающихся динамики передачи сигналов BMP, уровней и субклеточной локализации, а также может быть использован для диагностики. Поскольку этот путь лежит в основе нескольких заболеваний, BLA может быть использован для изучения других компонентов сигнальной транзакции BMP или других путей и может быть адаптирован для работы на срезах тканей или целых эмбрионах. Чтобы начать анализ близкого лигирования in situ, готовят клеточные культуры Neuro two A клеток в GMEM с добавлением 10% FBS однократных заменимых аминокислот, один раз пируват и один раз L-глутамин.

Разделите клетки с помощью трипсина и наберите от 15 000 до 20 000 клеток в лунку. В 16-луночной камере камеры инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение 24 часов. Через 24 часа.

Замените питательную среду добавкой ГМЭМ, не содержащей сыворотки, и инкубируйте еще два-три часа для контроля. Три лунки с клетками содержат в нормальном культуре и условиях после второй инкубации. Ингибируйте путь BMP, обрабатывая клетки двумя микромолярами морфина дорса, или индуцируйте передачу сигналов, обрабатывая клетки четырьмя микромолярами BMP в течение 10-60 минут.

После стимуляции клеток аспирируйте среду из лунок и аккуратно промойте клетки PBS, чтобы избежать отслоения клеток. Не наносите пипетку PBS непосредственно на клетки. Затем отсасывайте PBS и снимите камеры, но оставьте кремний вокруг лунок.

Добавьте в лунки 50 микролитров свежеприготовленного и отфильтрованного 4%-ного параформальдегида и выдерживайте 10 минут при комнатной температуре без перемешивания. После фиксации промыть клетки PBS в течение пяти минут при комнатной температуре с перемешиванием в банке с копином. Повторите стирку дважды, всего три стирки.

Далее проникните в клетки 0,5% Triton X 100 в PBS в банку с копином и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания. Затем промойте ячейки 0,05%tween 20 и TB S3 раза по пять минут за промывку с перемешиванием в соединительной банке. Начните процедуру блокировки, постучав по предметному стеклу, чтобы удалить окончательный раствор для стирки.

Следя за тем, чтобы клетки не высыхали. Добавьте по одной капле ссылки DUO к блокирующему раствору к каждому. Хорошо инкубируйте клетки в блокирующем растворе в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в предварительно разогретой увлажненной камере, состоящей из пустой коробки с наконечником для пипетки с дистиллированной водой.

Для приготовления первичных растворов антител разбавляют антифосфо смад 1, 5, 8 и анти SMAD четыре от одного до 100 в двойном звене два антитела. Используйте каждое антитело по отдельности и в комбинации. Теперь коснитесь предметного стекла, чтобы удалить блокирующий раствор со стекла и добавьте 40 микролитров раствора антител в соответствующие лунки, и отрицательный контроль может быть включен только с разбавителем.

Проделайте этот шаг быстро, чтобы клетки не пересохли. Теперь инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия в предварительно разогретой увлажненной камере в течение одного часа. Во время инкубации разведите два зонда PLA в разбавителе.

Для каждой реакции смешайте восемь микролитров каждого зонда и 24 микролитра разбавителя так, чтобы зонды были разведены в растворе от одного до пяти. После часовой инкубации выпустите первичный раствор антител и дважды промойте предметные стекла с помощью Duo link to Wash Buffer a в течение пяти минут при комнатной температуре при перемешивании в соединительной банке. Когда промывка будет завершена, постучите по оставшемуся буферу промывки A со слайдов и добавьте по 40 микролитров раствора зонда PLA в каждую.

Ну а теперь инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия в предварительно разогретой увлажненной камере. В течение одного часа дуэт подключается к лигационному материалу и подготавливает объем для лигирования смеси. Сначала вортексируя дуэтное звено с лигационным материалом и разбавляя его до одного раза в воде высокой чистоты.

Учтите, что в этот раствор добавляется фермент Лигаза один к 40 и на одну лунку нужно 40 микролитров смеси. После инкубации откачайте раствор зонда PLA от предметных стекол и дважды промойте их с помощью буфера для промывки. А в течение пяти минут при комнатной температуре с перемешиванием в соединительной банке во время последней промывки возьмите Duo link Ligase в морозильный блок, а затем добавьте его в раствор для лигирования до окончательного разведения один к 40 и Vortex.

Теперь постучите по конечному объему Wash Buffer A со слайдов и добавьте 40 микролитров лигирования. Смешайте с ферментом до тех пор, пока л. Выдержите предметные стекла в предварительно разогретой влажностной камере в течение 30 минут.

При температуре 37 градусов Цельсия разморозьте усилитель DUO Link и подготовьтесь к этапу амплификации во время инкубации, разбавив усилитель DUO Link в воде высокой чистоты до одного раза. Когда этап лигирования будет завершен, вытряхните раствор и дважды промойте предметные стекла буфером для промывки А в течение двух минут при комнатной температуре при перемешивании в соединительной банке во время последней промывки, добавьте в раствор амплификации полимеразу duo link до окончательного разведения 1 2 80 и вортекс. После того, как вы отсоедините буфер для промывки, добавьте в каждую лунку по 40 микролитров смешанного амплификатора и выдержите предметные стекла в темной предварительно нагретой влажностной камере в течение 100 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После завершения амплификационной инкубации откачайте раствор полимеразы из предметных стекол и промойте их в буфере В в течение 10 минут на промывку растительностью в соединительной банке, на этом этапе держите стекла подальше от света, потому что реагенты чувствительны к свету. После двух промывок опустите в 0,1 раза буфер промывки B. Теперь полностью удалите силикон из 16. Ну и сдвиньте затем примерно на 40 микролитров дуэта.

Привяжите монтажный носитель с помощью салфетки к покровному стеклу и аккуратно положите его на образцы, слегка прижав его так, чтобы под покровным стеклом не было пузырьков воздуха, закрепите и запечатайте покровное стекло на предметном стекле лаком для ногтей, подождая не менее 15 минут до визуализации. Это конфокальные изображения клеток, которые были обработаны двумя микромолярными морфином дорса, ингибитором пути BMP или обработаны 25 нанограммами на миллилитр. БМП четыре за 60 минут.

Антитела против Phospho Smad 1, 58 и Smad 4 использовались для обнаружения активных комплексов Smad, которые проявляются в виде красных пятен. Ядро клетки поддерживается синим цветом по dpi. Сигналы PLA подсчитывались с помощью программного обеспечения DUO link image tool, и среднее количество пятен в ядре на клетку представлено на графике.

При использовании любого из первичных антител по отдельности окрашивание не наблюдается, что указывает на отсутствие фонового обнаружения зондов PLA и последующего лигирования олигонуклеотидов. Аналогичным образом, не обнаруживаются пятна в другом отрицательном контроле, выделяющем оба первичных антитела. В нейронных двух клетках А страница SDS иммуноблоттинг выявляет связанный с фосфообами SMAD 1, 5, 8 в необработанных клетках и клетках, обработанных BMP.

Тем не менее, уровни фосфо смада заметно снижены в клетках, обработанных дорсальным морфином. Антитело против PCNA обеспечивает контроль нагрузки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как следовать шагам и настройкам, которые мы предлагаем, чтобы получить результаты менее чем через шесть часов после фиксации клеток.

Таким образом, этапы включают блокирование первичной инкубации антител, пробную инкубацию PLA, амплификацию лигирования, постановку визуализации.