Генерация Композитный Растения в Medicago прудовик Используется для нодуляции Анализы

Здравствуйте, меня зовут Оливер Ю, я сотрудник Центра растениеводства Дэна. Сегодня мы покажем вам, как получать трансгенные растения с помощью Agrobacterium Ogn. Этот метод был внедрен в Центр Дэна доктором Крисом Тейлором, который в настоящее время работает в Университете штата Огайо.

На протяжении многих лет несколько моих бывших сотрудников совершенствовали эти методы, и сегодня мои нынешние коллеги, доктор Стоун и Мао, подготовили данное видео, чтобы продемонстрировать процесс получения композитных растений методом Harry Root. Agrobacterium ZOS очень похожи на Agrobacterium tumefaciens тем, что они внедряют чужеродную ДНК в растения, однако ZOS могут индуцировать более интенсивное образование корней в тканях дикого типа, создавая композитные растения, подобные этому. Таким образом, в таких композитных растениях часть корней является трансгенной, в то время как побеги остаются дикого типа.

Таким образом, данная технология не приведет к созданию трансгенных семян. Тем не менее, существует три основных преимущества растений с высокой способностью к укоренению, которые делают эту технологию очень полезной. Во-первых, многие виды растений, особенно двудольные, могут быть трансформированы с помощью Agrobacterium.

Во-вторых, нам не нужно создавать культуру тканей перед трансформацией. Для прямого получения трансгенных растений можно использовать многие части растений, такие как проростки, побеги и корни. И наконец, мы можем получить трансгенную корневую ткань всего за несколько недель.

При трансформации сои и люцерны мы можем получить трансгенные корни всего за три недели, что быстрее, чем при трансформации методом OPIS. В целом, технология получения растений с повышенным содержанием корневых клеток является очень полезным инструментом для изучения функций генов и фенотипов, связанных с корнями. Здравствуйте, меня зовут Онг.

Здравствуйте, меня зовут [имя], а это мой оператор Билл. Сегодня мы представим протокол анализа композитных растений Harry root. Мы используем этот протокол в нескольких наших проектах.

Мы уже начали. Для нашей демонстрации в качестве примера мы будем использовать Metacargo Tula. Это зрелые поды Metacargo.

Поместите стручки в ступку и разотрите их длительными и уверенными движениями. Отделите семена от стручков, аккуратно встряхивая их, и поместите семена в центрифужную пробирку объемом 50 milliliter. Затем добавьте 5 milliliter концентрированной серной кислоты.

Очень осторожное скарифицирование. Занимает около 10 минут. Перемешайте содержимое пробирки вортексом два-три раза.

В процессе обработки кислотой семенная кожура окрасится в желтый цвет. Удалите серную кислоту из пробирки и промойте семена стерильной водой не менее пяти раз. Замочите семена в деионизированной воде при комнатной температуре на шесть часов, а затем выдержите их при температуре 4 °C в течение двух дней.

Для синхронизации прорастания распределите от 20 до 30 семян на увлажненной фильтровальной бумаге в чашке Петри. Через пять-шесть дней перенесите проросшие семена в почву, затем выращивайте их в теплице в течение четырех недель.

Для трансформации композитных растений обычно используют штамм Agrobacterium Zony K 5 99. Челночный или бинарный вектор может быть трансформирован в K 5 99 согласно стандартному протоколу трансформации Agrobacterium tumefaciens. Инокулируют Agrobacterium, культивируют при 30 °C в течение 16–24 часов. По завершении периода роста клетки собирают, перенося культуральный раствор в центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Центрифугируйте образец при 5, 000 G в течение 30 минут. Ресуспендируйте осадок в беззотистой питательной среде. Доведите плотность клеток agrobacterium до 0.3 при OD 600.

Данная концентрация имеет важное значение для обеспечения максимальной эффективности трансформации. В качестве поддерживающей матрицы мы используем стеночную породу. Использование этого материала необходимо для достижения высокой частоты трансформации.

Обрежьте стенку из скального материала до нужного размера. В верхней части каждой пробки проколите отверстие диаметром примерно 1,5–2 см. С помощью наконечника пипетки добавьте в каждую пробку 5 мл раствора ресуспендированных Agrobacterium Zony.

Выберите участок стебля с двумя-тремя пазушными почками и сделайте косой срез. Вставьте фрагменты растения в отверстие в скальной стенке. Поместите срезанные растения в камеру роста или на лабораторный стол на три недели.

Каждые 10 дней добавляйте по пять миллилитров питательного раствора в каждую пробку. Через три недели со стороны среза регенерируют корни. Поместите растение в воду.

Осторожно удалите размягченную каменную стенку, стараясь не повредить корни. Убедитесь, что каменная стенка удалена полностью. Композитные растения с волосистыми корнями можно пересадить в песок или перлит. Для экспериментов по симбиозу культивируйте ризобиум в среде с дрожжевым экстрактом (manito) в течение семи дней при 30 °C.

Соберите клетки zoia путем центрифугирования. Ресуспендируйте осадок в бесзотистом питательном растворе. Разбавьте раствор до значения OD 600, равного 0,08.

Добавьте по 10 milliliters раствора ZOA в каждую композитную культуру растений; выращивайте растения еще в течение двух-трех недель для формирования клубеньков. Удалите песок с композитных растений путем их выкапывания и промывки. Для проверки трансгенных корней используйте экспрессию зеленого флуоресцентного белка.

Для этого вам потребуется флуоресцентный микроскоп. Все наши конструкции волосатых корней содержат конститутивную кассету GFP для скрининга трансгенных линий. На этом изображении представлены композитные растения с трансгенными волосатыми корнями GFP, наблюдаемые под флуоресцентным микроскопом.

Трансгенные корни с более интенсивной зеленой флуоресценцией легко отличить от нетрансгенных корней. В волосистых корнях композитных растений образуются клубеньки. Ниже представлен полный протокол.

Повторим, что получение композитных растений с волосистыми корнями является быстрым и простым методом получения больших количеств трансгенной ткани, особенно для двудомных видов. Хотя этот метод не позволяет получить трансгенные семена, он дает возможность создать трансгенный материал за несколько недель. Данный подход особенно подходит для растений, которые трудно поддаются культивированию тканей и трансформации.

На протяжении многих лет мы использовали эту технологию для изучения функций генов, функций промоторов, микроРНК, развития корней и боковых корней, ответов на защитный и антибиотический стресс, нодуляции и других симбиотических процессов. Мы изучали гормональный ответ, метаболический профилинг, экспрессионный профилинг генов и проводили протеомный анализ с использованием композитных растений с развитой корневой системой. Мы надеемся, что это видео поможет вам адаптировать данную систему для ваших исследуемых видов.

Вы можете связаться с нами по вопросам, касающимся данной технологии. Желаем успехов!