Транскриптома Анализ отдельных клеток

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке образцов из отдельных клеток для анализа транскриптома. Это достигается путем предварительного нахождения клетки, пригодной для изоляции. Затем микропипетку располагают рядом с выделяемой клеткой.

Далее на шприц наносится отсасывание до тех пор, пока клетка не будет втянута в кончик микропипетки. Заключительным этапом процедуры является врезание кончика микропипетки в пробирку для сбора и выдавливание оставшегося содержимого микропипетки в пробирку. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие различия в популяциях мРНК между клетками, с помощью микроматричного анализа материала, амплифицированного с использованием метода амплификации арнк, также описанного в протоколе, или для других применений, таких как ПЦР или секвенирование нового поколения.

Хотя этот метод может дать представление о различиях между отдельными клетками, он также может быть применен к субклеточным компартментам, таким как дендриты или классы дендритов, и предоставить важную информацию о функции дендритов. Перед началом этого протокола первичные нейроны с эмбрионального дня 18-го дня, крысы Гиппо Кампи, были нанесены на 12-миллиметровые покровные листы в 35-миллиметровой чашке и поддерживались, как описано в письменном протоколе. Чтобы подготовить пипетки к забору, используйте микро-дозатор, чтобы вытянуть стеклянные пипетки автоклава до диаметра, соответствующего электрофизиологии.

При использовании предустановленной программы производителя размер отверстия не является критичным, так как наконечник будет сломан до сбора ячеек. Осторожно храните пипетки в защищенном от пыли месте, например в банке для хранения микропипеток, где наконечники останутся неповрежденными после сбора клеток. Приготовьте желаемое количество пробирок эйнора объемом 1,7 миллилитров, добавив два микролитра PBS для хранения собранного материала.

Извлеките 1 35-миллиметровую чашу из крышки из инкубатора в вытяжку для культуры тканей. Быстро перенесите одну защитную пластину из этой посуды на крышку новой 35-миллиметровой посуды, содержащей HBSS. Очень важно возвращать в инкубатор крышки, с которыми не манипулируют, так как клетки становятся нездоровыми.

Если оставить без внимания на длительные периоды времени. Для забора клеток необходим микроскоп с инвертированным светом и 40-кратным объективом, оснащенный микроманипулятором. Используйте держатель для пипетки с гибкой трубкой, ведущей в сторону от держателя, прикрепите трубку к устойчивой поверхности, чтобы предотвратить нежелательное перемещение пипетки во время сбора.

В конце трубки вставьте иглу так, чтобы можно было прикрепить одномиллилитровый шприц с замком приманки и менять его между пользователями. Подготовьте микропипетку, контролируемо сломав кончик, держа салфетку Кима между пальцами одной руки и очень осторожно проведя кончиком пипетки по бумаге один-два раза. Отверстие должно составлять примерно от 75 до 100% от размера целевой ячейки.

Закрепите микропипетку в держателе микропипетки и прикрепите держатель микропипетки к вкладышу на микроманипуляторах. Наконец, установите цель 40x. Поместите чашку на предметный столик микроскопа и найдите область клеток, подходящую для забора.

В случае первичных нейрональных культур клетка должна быть относительно изолирована от своих соседей. Чтобы предотвратить сбор окружающих клеток и/или процессов, поместите удаляемую клетку в центр поля зрения. С помощью микроманипулятора проведите микропипетку к раствору в чашке на световой путь.

Опустите наконечник пипетки в раствор. При взгляде через окуляр пипетка должна отображаться в поле зрения в виде тени. С этого момента надавливайте положительным давлением, слегка продувая через шприц значительно выше плоскости клеток.

Отрегулируйте положение наконечника пипетки так, чтобы он оказался в поле зрения, и сфокусируйтесь на наконечнике пипетки с помощью ручек фокусировки курса. На этом этапе оцените, является ли размер отверстия пипетки слишком большим или слишком маленьким. Если диаметр отверстия неправильный, замените его на другой микропипетку, пока не будет найден правильный размер отверстия, чтобы предотвратить поломку пипетки в области сбора.

Используйте фокус курса для продвижения фокальной плоскости, прежде чем продвигать наконечник пипетки к клеткам с помощью микромических манипуляторов. По мере того как ячейки становятся ближе, используйте тонкий фокус до тех пор, пока и ячейки, и наконечник пипетки не окажутся в фокусе. Прекратите оказывать положительное давление до того, как будут достигнуты ячейки истца, чтобы не сдуть их с защитного стекла.

Расположите наконечник пипетки с помощью микроманипуляторов так, чтобы он касался сомы клетки, которую необходимо собрать. С помощью шприца применяйте мягкое отсасывание ртом до тех пор, пока ячейка не войдет в наконечник пипетки. Если ячейка не входит в пипетку, осторожно переместите наконечник ближе к ячейке и вниз, пока он не поднимется от защитного стекла.

С помощью микроманипулятора немедленно переместите пипетку вверх и из раствора. Извлеките пипетку из держателя. Держите подготовленную пробирку эйнора объемом 1,7 миллилитра в одной руке, и аккуратно разломите кончик пипетки сбоку пробирки по направлению ко дну.

Нацелившись на отметку 0,1 миллилитра со сломанным наконечником по центру внутри трубки, вставьте иглу, прикрепленную к одномиллилитровому шприцу, в верхнее отверстие пипетки. Быстро нажмите на поршень, заставляя раствор из пипетки распыляться в трубку. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться кончиком к жидкости по бокам трубки.

Поскольку капиллярное действие возвращает жидкость обратно в пипетку, клетка должна оставаться на самом кончике пипетки, и этого должно быть достаточно для правильного выведения клетки. Быстро раскрутите содержимое пробирки с помощью настольного микрофуга и заморозьте на сухом льду или поместите на лед для дальнейшей обработки или для других применений, таких как ПЦР или секвенирование нового поколения. Здесь показан пример успешного сбора урожая изолированного нейрона.

Для начала была выбрана область клеток с относительно низкой плотностью. Затем наконечник пипетки продвигали к нужной ячейке. Здесь поле зрения показано после того, как клетка была собрана.

Обратите внимание, что окружающие процессы остаются на обложке. И наоборот, на этом рисунке показаны два изображения наконечников пипеток, размер которых не подходит для эффективного сбора. Этот совет приведет к неполному сбору урожая, в то время как показанный здесь совет приведет к сбору урожая в окружающей среде.

После сбора урожая и анализа амплификации А РНК рекомендуется использовать биоанализатор для изучения распределения и количества амплифицированной РНК. Успешная амплификация из материала одной клетки даст общее количество в микрограммах и будет иметь равномерное и широкое распределение.