Транскриптома Анализ отдельных клеток

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке образцов из одиночных клеток для анализа транскриптома. Для этого сначала подбирается клетка, подходящая для изоляции. Затем микропипетка позиционируется рядом с клеткой, которую необходимо изолировать.

Затем шприцем создается всасывание до тех пор, пока клетка не будет втянута в кончик микропипетки. Заключительным этапом процедуры является отламывание кончика микропипетки в пробирку для сбора и вытеснение оставшегося содержимого микропипетки в эту же пробирку. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие различия в популяциях mRNA между клетками с помощью микрочипового анализа материала, амплифицированного методом амплификации arna, который также описан в протоколе, или для других приложений, таких как PCR или секвенирование следующего поколения.

Хотя данный метод позволяет получить представление о различиях между отдельными клетками, его также можно применять к субклеточным компартментам, таким как дендриты или классы дендритов, что дает важную информацию о функции дендритов. Процедуру продемонстрирует Дженнифер Сингх, постдок в моей лаборатории. До начала данного протокола первичные нейроны гиппокампа крысы 18-го эмбрионального дня высеяли на покровные стекла диаметром 12 мм в чашках диаметром 35 мм и поддерживали в условиях, описанных в письменном протоколе. Для подготовки пипеток для сбора используйте микропуллер, чтобы вытянуть автоклавированные стеклянные пипетки до диаметра, подходящего для электрофизиологических исследований.

При использовании предустановленной программы производителя размер отверстия не является критическим, так как наконечник будет отломан перед сбором клеток. Тщательно храните пипетки в безпыльной среде, например, в контейнере для хранения микропипеток, чтобы наконечники оставались целыми до момента сбора клеток. Подготовьте необходимое количество пробирок объемом 1.7 мл, добавив в каждую по 2 µL PBS для хранения собранного материала.

Извлеките из инкубатора одну чашку диаметром 35 мм с покровными стеклами и поместите ее в ламинарный шкаф для работы с культурами тканей. Быстро перенесите одно покровное стекло из этой чашки на крышку новой чашки диаметром 35 мм с HBSS. Крайне важно вернуть неиспользуемые в данный момент покровные стекла в инкубатор, так как состояние клеток может ухудшиться.

Если образцы оставить на длительное время. Для сбора клеток необходим инвертированный световой микроскоп с объективом 40х и установленным микроманипулятором. Используйте держатель для пипеток с гибкой трубкой, выходящей из держателя; закрепите трубку на устойчивой поверхности, чтобы предотвратить нежелательное перемещение пипетки во время сбора.

В конец трубки вставьте иглу таким образом, чтобы к ней можно было присоединять и заменять шприц объемом 1 ml с соединением Luer Lock для каждого пользователя. Подготовьте микропипетку, контролируемо обломив кончик: для этого натяните салфетку Kimwipe между пальцами одной руки и очень осторожно проведите кончиком пипетки по бумаге один или два раза. Отверстие должно составлять примерно 75–100% от размера целевой клетки.

Закрепите микропипетку в держателе и установите держатель микропипетки в гнездо микроманипуляторов. Затем установите объектив 40x. Поместите чашку на предметный столик микроскопа и найдите область клеток, подходящую для сбора.

В случае первичных культур нейронов клетка должна быть относительно изолирована от соседних клеток. Чтобы избежать захвата окружающих клеток или их отростков, поместите клетку, которую необходимо собрать, в центр поля зрения. С помощью микроманипулятора переместите микропипетку в раствор в чашке в область освещения.

Опустите наконечник пипетки в раствор. При взгляде через окуляр пипетка должна быть видна в поле зрения в виде тени. С этого момента создавайте положительное давление, осторожно выдувая воздух через шприц значительно выше плоскости расположения клеток.

Отрегулируйте положение наконечника пипетки так, чтобы он оказался в поле зрения, и сфокусируйтесь на нем с помощью ручек грубой фокусировки. На этом этапе оцените, не является ли диаметр отверстия пипетки слишком большим или слишком маленьким. Если диаметр отверстия подобран неверно, замените микропипетку на другую до тех пор, пока не будет найден подходящий размер, чтобы предотвратить поломку пипетки в области сбора.

Используйте ручку грубой фокусировки, чтобы переместить фокальную плоскость, прежде чем приближать кончик пипетки к клеткам с помощью микроманипуляторов. По мере приближения к клеткам используйте ручку точной фокусировки до тех пор, пока и клетки, и кончик пипетки не окажутся в фокусе. Прекратите подачу положительного давления до того, как достигнете целевых клеток, чтобы избежать их сдувания с покровного стекла.

С помощью микроманипуляторов расположите наконечник пипетки так, чтобы он касался сомы клетки, которую необходимо собрать. Используя шприц, создайте осторожное вакуумное всасывание ртом до тех пор, пока клетка не进入 в наконечник пипетки. Если клетка не засасывается в пипетку, осторожно переместите наконечник ближе к клетке и вниз, пока она не оторвется от покровного стекла.

С помощью микроманипулятора немедленно переместите пипетку вверх и выньте ее из раствора. Извлеките пипетку из держателя. Держа в одной руке подготовленную пробирку типа «эппендорф» объемом 1,7 мл, осторожно отломите кончик пипетки о край пробирки ближе к ее дну.

Направляя сломанный наконечник в центр пробирки и ориентируясь на отметку 0,1 мл, вставьте иглу шприца объемом 1 мл в верхнее отверстие пипетки. Резко нажмите на поршень, чтобы раствор из пипетки выстрелил в пробирку. Следите за тем, чтобы наконечник не касался жидкости на стенках пробирки.

Поскольку капиллярный эффект вернет жидкость в пипетку, клетка должна остаться на самом кончике, чего будет достаточно для её правильного извлечения. Быстро осадите содержимое пробирки в настольной микроцентрифуге, затем заморозьте на сухом льду или поместите на лед для дальнейшей обработки или использования в других целях, таких как ПЦР или секвенирование следующего поколения. Здесь представлен пример успешного сбора изолированного нейрона.

Для начала был выбран участок с относительно низкой плотностью клеток. Затем наконечник пипетки был перемещен к выбранной клетке. Здесь показано поле зрения после сбора клетки.

Обратите внимание, что окружающие процессы остаются на покровном стекле. Напротив, на данном рисунке представлены два изображения наконечников дозатора, размер которых не подходит для эффективного сбора. Использование такого наконечника приведет к неполному сбору, в то время как наконечник, показанный здесь, приведет к сбору окружающей среды.

После сбора материала и амплификации РНК рекомендуется провести анализ с помощью биоанализатора для изучения распределения и количества амплифицированной РНК. При успешной амплификации из материала одной клетки общее количество РНК составит несколько микрограммов, а распределение будет плавным и широким. После освоения эта техника может быть выполнена за несколько минут при соблюдении всех правил; при проведении данной процедуры важно использовать методы работы в условиях отсутствия РНКаз.