Препарирование и обработка изображений активных зон в Drosophila Нервно-мышечном соединении

Общая цель этой процедуры заключается в проведении иммунофлуоресцентного окрашивания белков активной зоны у личинок третьей и звездчатой дрозофилы. Это достигается путем предварительного отбора и прикрепления личинок к чашке для вскрытия. Вторым этапом процедуры является вскрытие личинок с удалением лишней ткани, чтобы обнажить мышцы и нервно-мышечные соединения.

Третьим этапом процедуры является иммуноокрашивание вскрытых шкурок личинок непосредственно в чашке для вскрытия. Заключительным этапом процедуры является крепление шкурок личинок на предметное стекло микроскопа. В конечном итоге можно получить результаты морфологии активной зоны нервно-мышечного перехода СНО с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологии, такие как регуляция белков нервно-мышечного соединения, как когда-то участвующих в морфологии активной зоны Чтобы создать рассекающую поверхность, налейте сигару, 180 4 силиконового эластомера основу в небольшую тканевую культуральную пластину. Убедитесь, что пластина не заполнена полностью, чтобы область препарирования была ниже, чем обод Обрежьте штифты для препарирования до длины примерно от трех до пяти миллиметров для большей простоты манипуляций, и убедитесь, что на каждую личинку приходится не менее шести штифтов дикого типа и мутантных штаммов. Определите и выберите блуждающих личинок третьего возраста, которые активно ползают по стенке флакона и еще не начали окукливаться.

Извлеките из флаконов по две личинки от каждого генотипа и поместите их в посуду для мытья, наполненную PBS, для удаления мусора под стереомикроскопом. Удалите лишнюю влагу с поверхности рассечения с помощью салфетки. Расположите личинки так, чтобы спинная сторона была обращена вверх, а две белые трахеи были видны вдоль дорсальной стороны центра личинок.

Трахеи в середине личинок как бы отмечают ее дорсальное срединное место. Булавка номер один находится прямо над крючками для рта, а затем поместите булавку номер два в хвостовой позиции прямо над сферическими и между трахеями. Добавьте к личинкам небольшое количество PBS, чтобы не допустить пересыхания кутикулы.

Обязательно разделяйте разные генотипы, поместив булавку между каждой группой. После того, как личинки будут прижаты, сделайте поперечный разрез поперек трахеи прямо над булавкой номер два. Вставьте ножницы в этот разрез и разрежьте вдоль средней линии спины между трахеями до булавки номер один, если это необходимо.

Сделайте четыре дополнительных небольших надреза в самом верху и внизу каждой стороны кутикулы, чтобы левая и правая стороны открылись, что позволит вам прижать их, не натягивая кутикулу. После того, как каждый уголок кутикулы будет прижат к препарирующей подушечке, зафиксируйте личинки филе с помощью 4% параформальдегида на 20-25 минут при комнатной температуре. Примерно через 25 минут времени фиксации сцедите параформный альдегид и промойте PB S3 каждый раз сцеживая личинки по капле PBS под стереомикроскопом, захватите задний конец одной из трахеи рассекающими щипцами и вытащите его.

Повторите то же самое для второй трахеи. Возьмите часть задней жировой ткани тела или кишечника и вытяните ее из области рассечения. После того, как большая часть задней ткани будет удалена, сосредоточьтесь на удалении мелких тканей вокруг мозга.

Как только личиночная шкура освободится от лишней ткани, ее можно окрашивать непосредственно на препарирующую подушечку с использованием первичного антитела для распознавания активной зоны, а затем флуоресцентного вторичного антитела. Начните с сцеживания и отвода последней промывки после вторичной инкубации антител и пипеткой примерно один миллилитр 80% глицерина. Чтобы покрыть шкуры личинок, удалите все штифты, кроме одного, с каждой личинки, а затем поместите две капли монтажного материала на предметное стекло микроскопа.

Удалите последний штифт и схватите личинок за хвост тупыми щипцами. Перетащите личинки в глицерин, а затем поместите личинки в первую каплю монтажной среды и проделайте то же самое с оставшимися личинками того же генотипа. Как только все личинки окажутся в первой капле монтажной среды, захватите личинки одну за другой и протащите их через каплю, а затем вдоль сухих краев предметного стекла, чтобы удалить большую часть среды.

Затем поместите личинки во вторую монтажную среднюю каплю. Подготовьте окончательный слайд, нанеся на него маркировку и поместив на него маленькую Т-образную форму монтажного материала. Повторите процедуру перетаскивания и сушки с личинками во второй капле монтажной среды, а затем расположите личинок кутикулой вниз в монтажной среде.

На последнем слайде поместите защитный стекло на предметное стекло, чтобы покрыть расчлененные личинки начальной кромкой На верхней линии тройника поместите небольшой груз на защитное стекло примерно на пять минут, чтобы убедиться, что монтажный материал полностью расползается, а затем оставьте его в темноте, пока монтажный материал не затвердеет. Чтобы подготовить предметное стекло к микроскопии, сотрите остатки монтажного носителя и заклейте защитное стекло лаком для ногтей. Правильная ориентация шкурок личинок показана здесь.

Обратите внимание, что шкурки плоской кутикулой вниз и что между шкурками есть по крайней мере ширина тела личинки. После вскрытия личинок окрашивание и монтаж завершены. Микроскопия может быть использована для идентификации личиночных мышц, располагающихся в сегментах от двух до шести.

Используя объектив высокой мощности, можно сфокусироваться на одном синапсе и сделать стековое изображение ZS с помощью микроскопа. Здесь показано репрезентативное изображение максимальной проекции части синапса с окрашиванием NC 82 в зеленый цвет и пресинаптическим окрашиванием HRP в красный цвет. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как иммуноокрашивать важные белки нервно-мышечного соединения, такие как те, которые участвуют в морфологии активных зон.