Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Общая цель данной процедуры заключается в выделении эмбрионов мыши на стадии E 8.5 для последующего использования в анализах иммунопреципитации хроматина или ChIP-анализах. Сначала выделяют эмбрионы мыши и готовят суспензии одиночных клеток. Вторым этапом процедуры является химическая сшивка белков, связанных с ДНК, с геномной ДНК с последующим ультразвуковым воздействием (соникацией) для фрагментации ДНК.

Третьим этапом процедуры является иммунопреципитация белково-хроматиновых комплексов и выделение очищенной ДНК. Заключительным этапом процедуры является анализ очищенной иммунопреципитированной ДНК с помощью традиционной ПЦР или количественной ПЦР в реальном времени. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие взаимодействие белков с регуляторными последовательностями специфических генов дифференцировки при запуске программы дифференцировки в развивающихся тканях и органах.

Данный семестр поможет ответить на важный вопрос о запуске программы дифференцировки в ходе эмбриогенеза путем идентификации регуляторных факторов, которые взаимодействуют с регуляторными последовательностями специфических генов дифференцировки по мере обретения ими транскрипционной компетенции. Для начала данной процедуры у мыши, забитой на 8,5 эмбриональный день, удаляют рога матки. Согласно утвержденному протоколу, ткань с помощью ножниц переносят в чашку Петри, содержащую свежую среду для секционирования.

Аккуратно вырежьте каждое место имплантации по отдельности и поместите их в чашку Петри со свежей средой для диссекции, чтобы избежать избыточного кровотечения. С помощью пинцета удалите слой матки с каждого места имплантации, чтобы обнажить децидуальную оболочку. Изолируйте отдельные эмбрионы, используя пинцет. На данном этапе развития эмбрионы окружены париетальным желточным мешком, который контактирует с децидуальной тканью, висцеральным желточным мешком и амнионом.

Амнион представляет собой прозрачную мембрану, которая находится в непосредственном контакте с эмбрионом. Висцеральный желточный мешок расположен между амнионом и париетальным желточным мешком; у эмбрионов на стадиях от 8,5 до 9,5 дней он легко распознается по наличию выраженных кровеносных сосудов, питающих эмбрион. Извлеките каждый эмбрион из окружающих его мембран и перенесите их по отдельности в новую лунку с диссекционной средой для удаления излишков крови.

Затем перенесите каждый эмбрион в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 µL среды для диссекции. Гомогенизация изолированного эмбриона начинается с добавления 200 µL раствора коллагеназы типа II в каждую пробирку с эмбрионами.

Осторожно встряхивайте образцы в шейкере при 37 °C со скоростью 100 RPM в течение 20 минут. Затем ресуспендируйте образцы путем аккуратного постукивания для разрушения клеточных агрегатов. Перенесите клеточную суспензию на стерильный клеточный фильтр с размером ячеек 40 мкм, помещенный над микроцентрифужной пробиркой объемом 1,5 мл.

Непосредственно после этого налейте 600 µL 1X DPBS комнатной температуры на верхнюю часть клеточного сита для завершения разделения. После фильтрации суспензии удалите клеточное сито и центрифугируйте образцы при 4 000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. После центрифугирования удалите супернатант.

Суспендируйте каждый осадок в 1 mL 1X DPBS комнатной температуры. Затем центрифугируйте образцы при 4 000 ×g в течение одной минуты при комнатной температуре. После повторного удаления супернатанта повторно суспендируйте каждый осадок в 200 µL среды для диссекции комнатной температуры; проведите кросс-линкинг хроматина, добавив 5,6 µL 37% формальдегида в образцы объемом 200 µL для получения конечной концентрации формальдегида 1%.

Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте их при 4,000 G в течение трех минут при температуре 4 °C и удалите супернатант. Ресуспендируйте клетки в холодном 1X DPBS, содержащем коктейль ингибиторов протеаз (PIC) в концентрации 80 µL/mL. Затем снова центрифугируйте образцы при 4,000 G в течение трех минут при температуре 4 °C.

После удаления супернатанта образцы можно заморозить при температуре -80 °C; они остаются стабильными в течение нескольких месяцев. Перед соникацией разморозьте замороженный осадок клеток на льду или поместите осадок, полученный на предыдущем этапе, на лед. Ресуспендируйте осадок клеток в 100 µL буфера для SDS-лизиса комнатной температуры. Затем добавьте еще 100 µL буфера для SDS-лизиса комнатной температуры и ресуспендируйте образец путем пипетирования и инверсии.

Инкубируйте суспензию клеток на льду в течение 10 минут. После инкубации настройте прибор для фрагментации сшитой ДНК до размера от 200 до 500 пар оснований. В данной демонстрации используется Diagenode Rupture genomic DNA 200.

Обработайте образец ультразвуком, поместив его в ледяную суспензию. Не допускайте нагрева образца выше 4 °C или его замораживания. Центрифугируйте обработанный ультразвуком образец при 14 000 G в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Перенесите супернатант в новую пробирку eend DPH, предварительно охлажденную на льду. Разделите соникационный образец максимум на пять аликвот. Одну аликвоту храните при температуре −20 °C, чтобы оставить исходный материал для разрыва поперечных сшивок.

На следующем этапе разведите остальные аликвоты в десять раз в буфере для разведения на чипе, содержащем свежедобавленный PIC в концентрации 1 µL на 800 µL буфера. Сначала определите, какие скорости перемешивания будут использоваться для предварительной очистки, исходя из антител, применяемых для анализа белков на чипе. В данном случае используются A-биды, так как для анализа на чипе применяются кроличьи антитела.

Проведите предварительную очистку разведенного супернатанта, добавив 75 µL 50% раствора ДНК и белков спермы лосося. Инкубируйте смесь при температуре 4 °C в течение одного часа при перемешивании, после чего центрифугируйте образцы при 2 500 ×g в течение одной минуты при 4 °C. Перенесите супернатанты в новые предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки типа Eppendorf.

Добавьте четыре микрограмма антитела на образец в предварительно очищенный элюат и инкубируйте в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия при перемешивании. Начните с добавления 60 микролитров суспензии бус с ДНК спермы лосося и белком в каждый образец и инкубируйте при четырех градусах Цельсия при перемешивании в течение одного часа. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования осторожно слейте супернатант и удалите его, сохраняя комплекс ДНК-белок-гранулы на льду. Ресуспендируйте и промойте осадки с помощью буферов с первого по четвертый, как описано в письменном протоколе.

Каждая промывка состоит из пятиминутной инкубации с перемешиванием, за которой следует центрифугирование при 1000 G в течение одной минуты и удаление супернатанта после промывки. Элюируйте комплекс хроматин-антитело, ресуспендировав промытый комплекс хроматин-белок-бисер в 250 µL свежеприготовленного элюирующего буфера; интенсивно перемешайте каждый образец на вортексе в течение пяти секунд, затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 минут с перемешиванием, после чего центрифугируйте при 2 500 G в течение одной минуты. При комнатной температуре перенесите каждый элюат в новую пробирку типа Eppendorf.

Повторите процесс элюции и объедините элюат для каждого образца в одной и той же пробирке eph. Для разрыва поперечных сшивок добавьте 20 µL 5 M sodium chloride к каждому элюату объемом 500 µL. Для ранее отложенного входного контроля добавьте 40 µL 5 M sodium chloride на 1 mL.

Нагревайте EIT в водяной бане при температуре 65 °C в течение четырех часов. Для проведения анализа в ночном режиме нанесите по 10 µL каждого образца в контрольный вход на 2% аэрозольный гель рядом с маркером молекулярного веса в диапазоне от 0,1 до 1 kb для проверки размера фрагментов ДНК. ДНК будет выглядеть как размытая полоса (шлейф), а не как четкая полоса.

Выделите ДНК из каждого образца объемом 500 µL, используя набор для быстрой экстракции из геля Kaya Quick Gel Extraction Kit. Начните с добавления 600 µL буфера QG для оптимизации абсорбции ДНК силикатной мембраной в колонке Kaya Quick Spin, затем добавьте 200 µL изопропанола перед нанесением пробы на колонку. Проверьте смесь на наличие осадка SDS.

Если произошло осаждение SDS, образцы следует нагреть на водяной бане при 42 °C до полного растворения осадка. Затем нанесите образцы на колонки и элюируйте ДНК в соответствии с инструкциями производителя. SDS может подавлять активность ПЦР-полимеразы, поэтому перед проведением ПЦР его необходимо полностью удалить.

Инкубируйте каждый образец ДНК на льду для осаждения остаточного SDS, затем центрифугируйте при 14 000 G в течение одной минуты при температуре четырех градусов Цельсия. Перенесите SANE в новые пробирки Эппендорфа. Наличие ДНК можно определить с помощью традиционной ПЦР или количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) с использованием праймеров, специфичных для каждой анализируемой последовательности. Для одной реакции ПЦР или qPCR используйте от 5 до 10 µL общего экстракта ДНК; условия проведения ПЦР и qPCR могут различаться.

Однако ограниченное количество исходного материала требует дополнительных циклов ПЦР для обычного ПЦР-детектирования; начните с 40 циклов и при необходимости скорректируйте их число. С использованием данного протокола чипы были изготовлены из эмбрионов на стадиях E 8.5 и E 9.5. Очищенные с помощью чипов ДНК анализировали методом обычной ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени.

Результаты демонстрируют, что миогенный и регуляторный фактор присутствует на миогенном и промоторе в эмбрионах E 8.5 и E 9.5. Напротив, в области дубового мешка, где миогенный не экспрессируется, признаков связывания миогенного с миогенным и промотором обнаружено не было. В качестве отрицательного контроля последовательности был использован промотор интерферона гамма, который содержит последовательности, соответствующие сайту связывания миогенного; как и ожидалось, миогенный не связывался с промотором интерферона гамма ни в одном из протестированных образцов тканей.

Результаты показывают, что Myogenic связывается с промотором Myogenic в сомитах эмбрионов E 8.5 и E 9.5, так как myo Genin специфически экспрессируется в сомитах на этих стадиях. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изолировать и подготавливать эмбрионы мыши E 8.5 для проведения иммунопреципитации хроматина, которая позволит идентифицировать регуляторные факторы, связанные с тканеспецифичными генами в развивающихся тканях.