Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Общая цель этой процедуры заключается в выделении эмбрионов E 8.5 мышей для использования в анализах хроматина, иммунопреципитации или чипов. Это достигается путем выделения эмбрионов мышей и приготовления суспензий одиночных клеток. Вторым этапом процедуры является химическое сшивание белков, связанных с ДНК, с геномной ДНК с последующей ультразвуковой обработкой для фрагментации ДНК.

Третьим этапом процедуры является иммуноосаждение белковых хроматиновых комплексов и выделение очищенной ДНК. Заключительным этапом процедуры является анализ очищенной иммунопреципитированной ДНК с помощью обычной ПЦР или количественной ПЦР в реальном времени. В конечном итоге могут быть получены результаты, показывающие взаимодействие белков с регуляторными последовательностями специфических генов дифференцировки во время инициации программы дифференцировки в развивающихся тканях и органах.

Этот семестр может помочь ответить на хороший вопрос о начале программы дифференцировки во время эмбриогенеза путем идентификации регуляторных факторов, которые взаимодействуют с регуляторными последовательностями дифференцировки специфического гена по мере того, как они становятся транскрипционно компетентными. Чтобы начать эту процедуру, у мыши, принесенной в жертву на 8,5-й день эмбриона, удаляют маточные рога. Согласно утвержденному протоколу, ткань с помощью ножниц помещается в чашку Петри, содержащую свежие срезы.

Разрежьте каждый участок имплантации по отдельности и поместите их в чашку Петри, содержащую свежую среду для вскрытия, чтобы избежать избытка крови. С помощью восьми щипцов удалите маточный слой с каждого места имплантации, чтобы обнажить de sidu изолировать отдельные эмбрионы с помощью щипцов. На этой стадии развития эмбрионы окружены париетальным желточным мешком, который контактирует с тканью деума, висцеральным желточным мешком и амнионом.

Амнион представляет собой прозрачную оболочку, которая находится в непосредственном контакте с эмбрионом. Мешок с висцеральным желтком расположен между амнионом и париетальным желточным мешком и легко различим среди 8,5 для еды 9,5 эмбрионов по наличию выступающих кровеносных сосудов, которые питают эмбрион. Удалите каждый эмбрион из окружающих его оболочек и перенесите по отдельности в новую пластину, содержащую диссекционную среду для удаления избытка крови.

Затем перенесите каждый эмбрион в эйноровую пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 200 микролитров диссекционной среды. Гомогенизация выделенного эмбриона начинается с добавления 200 микролитров коллагеназы. Введите второй раствор в каждую эйнорскую трубку, содержащую эмбрионы.

Осторожно встряхните образцы в вибростенде с температурой 37 градусов Цельсия при 100 об/мин в течение 20 минут. Затем повторно суспендируйте образцы, поглаживая, чтобы разрушить скопления клеток. Нанесите клеточную суспензию на верхнюю часть стерильного клеточного фильтра размером 40 микрон, помещенного на пробирку объемом 1,5 миллилитра

Немедленно нанесите 600 микролитров комнатной температуры один X-D-P-B-S на верхнюю часть ситечка ячейки, чтобы завершить разделение. После того, как суспензия будет процежена, выбросьте сетчатый фильтр и центрифугируйте образцы при 4000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость reus.

Суспензируйте каждую гранулу в одном миллилитре комнатной температуры по одному X-D-P-B-S. Затем центрифугируйте образцы при 4000 G в течение одной минуты при комнатной температуре. После повторного отбрасывания сната повторно суспендируйте каждое нёбо в 200 микролитрах среды для рассечения при комнатной температуре, сшите хроматин, добавив 5,6 микролитров 37% формальдегида к образцам объемом 200 микролитров для получения конечной концентрации 1% формальдегида.

Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре после инкубации, центрифугируйте образцы при 4000 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки холодом, одним X-D-P-B-S, содержащим 80 микролитров на миллилитр коктейля ингибиторов протеазы или PIC. Затем центрифугируйте образцы при 4000 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

После отбрасывания надосадочной жидкости образцы могут быть заморожены при температуре минус 80 градусов Цельсия и стабильны в течение нескольких месяцев, прежде чем ультразвуковая обработка разморозит замороженную клеточную гранулу на льду или поместит гранулу предыдущего этапа на лед. Повторно суспендируйте клеточную палитру в 100 микролитрах буфера для лизиса SDS комнатной температуры после реактивной суспензии. Дополнительно добавляется 100 микролитров буфера для лизиса SDS комнатной температуры, и образец ресуспендируется путем пипетирования и инверсии.

Инкубируйте клеточную суспензию на льду в течение 10 минут. После инкубации настройте атор на срезание сшитой ДНК до 200-500 пар оснований. В данной демонстрации используется DIO geno bio rupture UCD 200.

Просните образец ультразвуком в окружении ледяной жижи. Не допускайте нагревания выше четырех градусов по Цельсию или замораживания центрифуги. Образец ультразвука при 14 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Переложите надосадочную жидкость в свежий конец пробирки DPH, предварительно охладите на льду. Разделите обработанный ультразвуком образец максимум на пять аликвот. Храните одну аликвоту при температуре минус 20 градусов Цельсия, чтобы зарезервировать ее вход для перекрестной сшивки.

На шаг разбавьте остальные аликвоты в десять раз в буфере для разбавления чипа, содержащем свежедобавленный PIC, в соотношении один микролитр на 800 микролитров буфера. Во-первых, определите, какие аэродинамические скорости будут использоваться для предварительного очищения на основе антитела, которое будет использоваться для белка анализа чипа. Бусины здесь используются, потому что антитела, которые будут использоваться для чипа, бешеные.

Предварительно очистите разведенный суперин, добавив 75 микролитров 50% спермы лосося, ДНК и белка. Аэродинамическая скорость инкубации составляет четыре градуса Цельсия с вращением в течение одного часа после инкубации образцы центрифугируются при температуре 2500 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Переложите лежачие отверстия в новую предварительно охлажденную трубку DPH.

Добавьте четыре микрограмма антител на образец к предварительно очищенной Eloqua и инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с вращением. Начните с добавления 60 микролитров спермы лосося, белка ДНК, суспензии аэроса в каждый образец и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия с вращением в течение одного часа. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

Последующее центрифугирование. Осторожно удалите лежачие мышцы и выбросьте, держа комплекс белков ДНК на льду. Реаниматоры подвешивают и моют поддоны, как описано в письменном протоколе, с буферами от одного до четырех.

Каждая промывка состоит из пятиминутного инкубационного периода с вращением, за которым следует центрифугирование при 1000 G в течение одной минуты и удаление надосадочной жидкости после промывки. Комплекс антител к хроматину разбавляют препаратом Resus, суспендируя промытый белковый комплекс хроматина в 250 микролитрах свежеприготовленного элюирующего буфера, энергично обрабатывают каждый образец в течение пяти секунд, а затем инкубируют образцы при комнатной температуре в течение 15 минут с вращением после центрифугирования при 2500 G в течение одной минуты. При комнатной температуре переложите каждый элюат в новую пробирку eph.

Повторите процесс элюциана и соедините элюат для каждого образца в одной пробирке eph. Чтобы перевернуть поперечные связи, добавьте 20 микролитров пяти моэр хлорида натрия в каждый элюат 500 микролитров. Для ранее зарезервированного входного контроля добавьте 40 микролитров пяти моэр натрия хлорида на миллилитр.

Нагревайте ЭИТ на водяной бане при температуре 65 градусов Цельсия в течение четырех часов. На ночь запустите по 10 микролитров каждого образца во входном контроле на 2%-ном геле рядом с маркером размера от 0,1 до одной пары оснований, чтобы проверить размер фрагмента ДНК. ДНК будет выглядеть в виде мазка, а не резкой полосы.

Восстановите ДНК из каждого образца объемом 500 микролитров с помощью набора для быстрой экстракции геля kaya. Начните с добавления 600 микролитров буфера qg для оптимизации абсорбции ДНК с кремнеземной мембраной в колонке быстрого вращения кайя, а затем добавьте 200 микролитров изопропанола перед загрузкой колонки. Проверьте смесь, чтобы определить, присутствует ли осадок SDS.

Если произошло выпадение осадков SDS, образцы следует прогреть на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия до тех пор, пока осадок не исчезнет. Затем нанесите образцы на колонки и элюируйте ДНК в соответствии с инструкциями производителя. SDS может влиять на активность ПЦРТ-полимеразы и поэтому должна быть полностью удалена перед проведением ПЦР.

Инкубируйте каждый образец ДНК на льду, чтобы осадить остаточные паспорта безопасности, и центрифугируйте при 14 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Переведите SANE в новые эйнорские трубки. ЭИТ ДНК могут быть обнаружены либо с помощью обычной ПЦР, либо с помощью количественной ПЦР в реальном времени или КПЦР со специфичными для праймера Для каждой анализируемой последовательности используйте от пяти до 10 микролитров от общего ДНК ИИТ для одной реакции ПЦР или КПЦР, условия ПЦР и КПЦР будут варьироваться.

Тем не менее, ограниченное количество исходного материала требует дополнительных циклов ПЦР для обычного обнаружения ПЦР, начиная с 40 циклов и корректируя по мере необходимости. С использованием этого протокола были проведены чипы из эмбрионов E 8.5 и E 9.5. Очищенные чипами ДНК анализировали с помощью обычной ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени.

Результаты показывают, что миогенный и регуляторный фактор присутствует на миогенном и промоторе у эмбрионов E 8.5 и E 9.5. Напротив, не было никаких признаков миогенности и связывания с миогенным и промотором в дубовом мешке, где миогенный не экспрессируется. Промотор интерферона гамма, который содержит последовательности, соответствующие сайту миогенного связывания, использовали в качестве контроля отрицательной последовательности, поскольку ожидалось, что миогенный не связывался с промотором интерферона гамма ни в одном из протестированных образцов ткани.

Результаты показывают, что миогенный связан с миогенным промотором в сомитах эмбрионов E 8.5 и E 9.5, так как миогенин специфически экспрессируется в сомитах На этих стадиях, после просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее представление о том, как изолировать и подготовить эмбрионы мыши EA 0.5 к оценке осаждения хроматина, которая определит регуляторные факторы, обнаруженные для тканеспецифических генов в развивающихся тканях.