Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Общая цель данной процедуры — выделение нейральных стволовых клеток человека из отработанной ткани фронтальной коры. Это достигается путем предварительной подготовки растворов и материалов перед диссекцией плодов головного мозга человека. Затем следует поддержание выделенных нейральных стволовых клеток, включая их дальнейшую экспансию, характеристику и проведение экспериментов.

Возможно долгосрочное хранение, а также создание субкультур для дифференцировки клеток-предшественников в нейрональные и глиальные типы клеток. В конечном итоге, дифференцировку клеток нормальной ЦНС можно охарактеризовать и сравнить с дифференцировкой клеток, полученных из ЦНС с известными неврологическими расстройствами. Значение данного метода распространяется на терапию или диагностику любого заболевания ЦНС человека.

Данный метод представляет собой простую и надежную платформу для оценки патологического состояния S и анализа фармакологической эффективности новых препаратов для лечения данного расстройства. В связи с исключительной ценностью мультипотентных клеток все материалы должны быть подготовлены до начала выполнения протокола. Чтобы минимизировать риск повреждения образцов, заранее подготовьте охлажденный набор для диссекции, культуральную среду, подогретую до 37 °C, и охлажденную среду для замораживания клеток для длительного хранения.

Для криоконсервации и диссекции подготовьте стерильные автоклавированные пинцеты и скальпели с лезвиями и ручками для диссоциации клеток. Подготовьте автоматический дозатор, переносные пипетки объемом 10 мл и клеточный фильтр с размером пор 40 мкм. Также отставьте в сторону несколько культуральных чашек диаметром 10 см для проведения диссекции.

Центрифужные пробирки объемом 50 мл для диссоциации. Центрифужные пробирки объемом 1,5 мл для хранения тканей и криопробирки для заморозки клеток. Для обеспечения успеха жизнеспособную ткань от плодов в возрасте 18–22 недель необходимо собрать в течение двух часов с момента ее получения.

В идеале ткани плода следует получить в течение нескольких минут после их извлечения, заранее договорившись о сборе материала после плановых процедур. Ткани часто оказываются фрагментированными, однако значительная часть мозга остается неповрежденной. Поместите мозг в чашку Петри объемом 10 мл, наполненную ледяной средой для диссекции.

Идентифицируйте различные отделы коры по анатомическим ориентирам. Границы фронтальной, теменной и затылочной коры определяются по экстраполированному пересечению центральной борозды и сильвиевой щели. С помощью хирургических лезвий вырежьте ткань из фронтальной коры кпереди от центральной борозды и вдоль края сильвиевой щели.

Убедитесь, что желудочек остался целым и не поврежден. Теперь удалите остатки крови и мозговые оболочки из отделенного блока фронтальной коры. Если образец не слишком фрагментирован и достаточно велик, разделите блок на несколько более мелких образцов, чтобы оставить часть для гистологии и анализа белков или мРНК.

Теперь перенесите блок мозга в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте охлажденную до 0 °C среду для диссекции в объеме, в три раза превышающем объем ткани. С помощью пипетки осторожно гомогенизируйте ткань до полного ее фрагментирования. Для получения однородной суспензии клеток пропустите их через клеточный фильтр с размером пор 40 мкм.

Теперь центрифугируйте клеточную суспензию и ресуспендируйте клеточный осадок в 10 миллилитрах свежей теплой культуральной среды. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток и рассчитайте объем, соответствующий 2 миллионам клеток. Перенесите объем, содержащий 2 миллиона клеток, в культуральный флакон площадью 25 квадратных сантиметров.

Подготовьте среду, используя пять миллилитров теплой культуральной среды. Содержите клетки при температуре 37 °C в атмосфере с 5% carbon dioxide в течение одной недели. Для длительного культивирования раз в неделю заменяйте половину среды. Через одну-две недели культивирования обычно формируются нейросферы, диаметр которых составляет от 200 до 400 мкм.

Для диссоциации нейросфер на отдельные клетки инкубируйте клетки с EDTA в среде Хэнкса в течение 15 минут. Чтобы подготовить суспензию клеток к субкультивированию, центрифугируйте их, промойте средой Хэнкса и перенесите клетки в теплую культуральную среду.

Для инициации дифференцировки высейте диссоциированные клетки на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином и ламинином 1, с плотностью 100 000 клеток на стекло, и инкубируйте в течение 30 минут. Клетки могут легко дифференцироваться в олигодендроциты, нейроны или астроциты.

Для нейрональной дифференцировки культивируйте клетки в среде с B 27 в течение семи дней. Для дифференцировки в астроциты поддерживайте клетки в среде с FBS в течение семи дней. Для олигодендроцитарной дифференцировки культивируйте клетки в модифицированной среде с факторами роста в течение двух дней, после чего в течение следующих пяти дней используйте ту же модифицированную среду без факторов роста для хранения стволовых клеток.

После центрифугирования суспензий диссоциированных клеток ресуспендируйте клетки в среде для замораживания с концентрацией 10 миллионов клеток на флакон. Медленно заморозьте клетки при -20 °C, после чего поместите их при -80 °C для длительного хранения. Перенесите их в жидкий азот.

Затем клетки быстро размораживают на водяной бане при 37 °C и ресуспендируют в подогретом DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки для промывки. После этого подогретые клетки центрифугируют, супернатант аспирируют, а осадок ресуспендируют в подогретой культуральной среде.

Нейральные стволовые клетки среднего размера, полученные из нормального плода. На 18-й неделе гестации их культивировали для формирования нейросфер, которые затем трансфицировали GFP. Нейросферы дифференцировали для получения нескольких типов клеток, которые затем фиксировали и окрашивали с помощью клеточных маркеров и румина.

Мультипотентность подтверждается экспрессией маркеров, характерных для нейронов, астроцитов и олигодендроцитов. После просмотра данного видео вы получите четкое представление о том, как выделять, экспансировать и манипулировать нейральными стволовыми клетками человека из удаленных тканей фронтальной коры. Эти области предоставляют уникальную возможность изучать механизмы заболеваний коры головного мозга человека и тестировать потенциальную эффективность фармакотерапевтических средств.