ampliPHOX Колориметрические обнаружения на ДНК-микрочипов по гриппу

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании нового и быстрого метода усиления сигнала для обнаружения и характеристики подтипов вируса гриппа на чипе гриппа, микрочипе низкой плотности. Это достигается за счет включения биотинилированных АКДС и использования праймеров с пятью простыми фосфольными концами для амплификации сегмента матричного гена и неструктурного сегмента гена из экстрактов РНК гриппа. За ПЦР следует ферментативное расщепление и фрагментация для получения короткого одноцепочечного биотинилированного и амплифицированного вирусного продукта, который затем гибридизуется с матрицей после гибридизации.

Fox detection использует фотополимеризацию для выращивания больших полимерных пятен в местах гибридизации, а дифференциальные модели гибридизации используются для обнаружения подтипов вируса гриппа. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как стандартное флуоресцентное детектирование, заключается в том, что она довольно недорогая и обеспечивает быстрый результат, видимый невооруженным глазом, с аналитической чувствительностью, аналогичной флуоресценции. Тем не менее, этот метод может дать представление о характеристике вирусов гриппа с помощью чипа гриппа, потому что это универсальный метод обнаружения.

Ampl Fox также может быть применен к широкому спектру других систем, таких как другие микрочипы низкой плотности на основе ДНК и белков. Теоретически любой биотинилированный продукт должен быть обнаружен с помощью amox. Демонстрировать процедуру будут Эмбер Тейлор, младший научный сотрудник, и Кевин Моултон, научный сотрудник из Endeavour, которые оба были центральными в разработке инструмента Fox и химии обнаружения в течение последних нескольких лет.

Извлечь вирусную РНК из 200 микролитров вирусного изолята с помощью набора для экстракции вирусной РНК и протокола производителя. Разбавьте 60 микролитров от конечного объема и храните экстракты при температуре минус 70 градусов Цельсия или ниже для последующего использования. Затем приготовьте мастер-смесь R-T-P-C-R на ICE в соответствии с протоколом производителя.

Используя БИОТИНИЛИРОВАННУЮ смесь DNTP, добавьте смесь грунтовки для чипсов от гриппа, которая содержит концентрации, указанные в исходной смеси. Один праймер из каждого набора должен содержать пять основных фосфоловых групп для облегчения ферментативного пищеварения. Набор праймеров flu a производит продукт из пары оснований 1032, а набор праймеров flu B производит продукт из пары оснований 811.

и распределите 18 микролитров мастер-смеси по тонкостенным ПЦР-пробиркам. Затем добавьте по два микролитра РНК-матрицы в каждую реакционную пробирку. Перенесите ПЦР-пробирки в термоамплификатор и используйте циклический профиль с соответствующей температурой колена.

Профиль цикличности, используемый в этом анализе, показан здесь. Приготовьте смесь для ферментативного разложения, смешав 2,2 микролитра ферментного реакционного буфера, 0,8 микролитра воды, свободной нуклеазы, и 1,0 микролитра фермента лямбда-экзонуклеазы за одну реакцию ПЦР. Извлеките образцы из термоамплификатора и добавьте по четыре микролитра в каждую ПЦР-пробирку.

Верните образцы в термоамплификатор и запрограммируйте его, как показано, на 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем на 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем нанесите одноразовые гибридизационные лунки вокруг микрочипов, которые будут гибридизированы. Затем промойте слайды в 110 миллилитрах очищенной воды на орбитальном шейкере в течение пяти минут.

Высушите предметные стекла, аккуратно прикоснувшись салфеткой к краю лунки. Соедините 22 микролитра двух гибридизационных буферов с каждым из фрагментированных одноцепочечных продуктов ДНК, кратковременно перемешанных и пипеткой по 40 микролитров в лунки микрочипа. Дайте предметным стеклам гибридизоваться в течение одного часа в камере влажности после гибридизации, выньте предметные стекла из камеры влажности и кратковременно промойте каждое предметное стекло двумя миллилитрами буфера для промывки D. Поместите предметные стекла в решетку для слайдов.

Далее добавьте 110 миллилитров буферов для промывки А и В в отдельные емкости с помощью орбитального шейкера. Промойте решетку в буфере A со скоростью от 60 до 90 об/мин, скоростью, используемой для всех последующих стирок, в течение одной минуты. Затем извлеките решетку для слайдов из буфера для промывки A и кратко промойте буфером для промывки D. Переместите решетку для слайдов в буфер для промывки B и стирайте на орбитальном шейкере в течение пяти минут.

После промывки аккуратно просушите массивы на каждом слайде салфеткой и поместите высушенные слайды в камеру влажности. При подготовке к этапам определения цветовой метрики лисы соедините 10 микролитров амплитуды, 20 микролитров двух амплитудных буферов и 10 микролитров очищенной воды для каждого обрабатываемого массива, перенесите 40 микролитров смеси этикеток в каждый массив и дайте протекать реакции мечения в закрытой камере влажности в течение пяти минут во время гибридизации. Приготовьте в емкости 110 миллилитров промывочного буфера С. После нанесения маркировки немедленно промойте каждый массив с помощью буфера для промывки D. Поместите каждую горку в решетку для слайдов и промойте и промойте буфер C на орбитальном шейкере на пять минут после буферной морской промывки, кратковременно погрузив решетку для слайдов три раза в емкость с очищенной водой.

Чтобы удалить остатки солей, высушите массивы, как показано ранее. Храните массивы в темной коробке слайдов до активации фотографий и визуализации, которые должны быть завершены в течение 24 часов. Затем включите считыватель Amli Fox и убедитесь, что программное обеспечение Amli view готово к активации фотографий перед обнаружением матрицы образцов.

Во-первых, определите оптимальное время активации фотографий для всех образцов, выполнив короткую процедуру калибровки. Один раз за день использования, затем подогрейте раствор Amplify до комнатной температуры и кратковременно смешайте пипетку три микролитра усилителя усилителя с флаконом Amplify и тщательно перемешайте. В течение 10 секунд равномерно нанесите 40 микролитров раствора Amplify только на одно предметное стекло за раз, следя за тем, чтобы на нем не было пузырьков.

Вставьте предметное стекло микрочипа в отсек для активации фотографий считывателя Amplify. Начните активацию фотографий с выбора, запустите в программном обеспечении для просмотра фотографий с использованием времени активации фотографий, определенного в процессе калибровки. После завершения промойте микрочип двумя миллилитрами очищенной воды, чтобы удалить излишки амплификации. Образование прозрачного полимера теперь происходит на участках, содержащих целевую ДНК, но лучше визуализируется.

После окрашивания дайте полимерным пятнам высохнуть в течение двух минут. Затем нанесите две капли красного цвета на матрицу и дайте продолжить окрашивание в течение двух минут После окрашивания быстро промойте предметное стекло очищенной водой и высушите, как показано ранее, вставьте предметное стекло в отсек для визуализации считывателя Amli Fox, чтобы собрать изображение с помощью программного обеспечения amli для обработки результатов. На левом изображении показано обнаружение романа 2009 года H One N one экземпляра Амли Фокс.

В то время как изображение справа использует традиционную флуоресценцию, генерируемую конфокальным флуоресцентным микрочиповым сканером, для обоих методов можно легко увидеть одну и ту же общую картину обнаружения. Тем не менее, результат амли лисы виден невооруженным глазом. На этих изображениях показаны результаты чипа гриппа человеческого происхождения, H три N два человеческого происхождения, H один N один, происхождение свиньи, H один N один и отрицательный массив лисицы без обнаруживаемого гриппа.

Вторая и третья последовательности, обведенные синим цветом, дают сигнал для всего гриппа. Показаны подтипы, но последовательности, выделенные красным цветом в правом нижнем углу, дают сигнал только о происхождении свиньи: H один N один экземпляр. Отрицательный образец показывает сигнал на внутренней контрольной последовательности, обведенной зеленым цветом, что указывает на отсутствие торможения или сбоя реакции R-T-P-C-R.

После освоения весь процесс, от экстракции флакона до обнаружения амокса и интерпретации окончательного результата, может быть выполнен примерно за шесть часов. Часть процедуры обнаружения Ampl Fox, включая калибровку прибора, может быть завершена примерно за 30 минут После этой процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы могут быть выполнены и другие методы, такие как частичное или полное секвенирование генома.

Этот анализ на грипп предназначен для первоначального скрининга, особенно для образцов, которые приводят к уникальному шаблону гибридизации. Поскольку обнаружение является общим анализом, мы надеемся, что исследователи найдут новые и интересные приложения микрочипов низкой плотности, для которых обнаружение может принести дополнительную пользу.