Характеристика Изолированные, вентилируемый и легких мыши Instrumented озарен пульсирующего потока

Изучить пульсирующие соотношения легочного давления в потоке. В этом протоколе объясняется, как изолировать, вентилировать и перфузировать легкие мыши. Трахея хирургическим путем обнажается для вентиляции.

Затем сердце и легкие изолируются, чтобы можно было канюлировать легочную артерию и левое предсердие. Затем проводится перфузия легочной системы. Эксперименты проводятся путем изменения кровотока, величины, формы волны и/или частоты легочной артерии.

Полученные в результате формы волны давления в легочной артерии и левом предсердии регистрируются и демонстрируют соотношения пульсирующего потока легочного давления. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как препараты in vivo, заключается в том, что изменяется соотношение давления потока. Соотношения потока пульсирующего давления могут быть получены при отсутствии изменений объемного статуса, тонуса симпатической нервной системы, активности и эффектов анестезии.

Кроме того, большинство изолированных препаратов легких измеряют только постоянные соотношения потока давления, в то время как наша методика позволяет определить пульсирующие соотношения потока давления. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии легких, такие как как поражение легочных сосудов влияет на пульсирующую легочную гемодинамику или как уплотнение крупных легочных артерий влияет на постнагрузку правого желудочка? Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как обнажение сердца и легких и закрепление канюли в легочной артерии трудно освоить.

Избыточное давление от инструментов может вызвать отек легких, а неправильное размещение канюли может привести к проколу легочной артерии. Перед началом эксперимента необходимо подготовить систему IL one, используемую для вентиляции и перфузии изолированного легкого. Трубка должна быть подсоединена к преобразователям давления.

Одиночное насос и расходомер полностью Промойте систему дистиллированной водой, нагретой до 37 градусов Цельсия, и удалите все пузырьки в трубке. Затем загрунтуйте трубку технологического насоса Endur 1% PBS. Теперь ноль.

Давление для каждого преобразователя P 75 путем предварительного закрытия его клапана в системе IL one и открытия его клапана в атмосферу. Затем используйте усилитель SIS для автоматического обнуления давления перед подготовкой, увлажните животное установкой IO One, замочив керамическую пористую деталь в дистиллированной воде. После обезболивания мышь стабилизируют ее для операции, прижав ее передние лапы к пробковой доске.

Теперь опрыскайте грудь 95%-ным спиртом. С помощью прямых щипцов захватите кожу на шее и вырежьте прямым ножницами отверстие в один сантиметр. Как только внутренняя часть шеи будет обнажена, отрежьте белую железистую ткань в поверхностных мышцах, ища пищевод и трахею.

Изолируйте пищевод и трахею от тканей с обеих сторон и сзади и завяжите рыхлый шов вокруг трахеи. Чтобы канюлировать трахею, аккуратно вырежьте маленькими ножницами маленькую букву V с одной ее стороны. Теперь поднесите мышь к системе IL one с помощью тупых щипцов.

Возьмитесь за канюлю трахеи и вставьте ее в трахею. Закрепите канюлю швом. Сначала начните проветривание комнатным воздухом, опрыскайте грудь спиртом и снимите кожу с помощью прямых щипцов и прямых ножниц.

Разрежьте кожу вверх вдоль грудины. Приподнимите кожу с каждой стороны и разрежьте по линии нижних ребер. Теперь возьмитесь за мечевидный отросток пинцетом и с помощью ножниц с шариковым кончиком прорежьте отверстие в диафрагме, где он встречается с нижней частью грудины.

Возьмитесь за диафрагму и отрежьте ее от ребер. Используя ножницы с шариковым наконечником, снова возьмитесь за мечевидный отросток и с помощью ножниц со шариковым наконечником осторожно разрежьте грудину через ребра, не повреждая легкие, сердце или кровеносные сосуды. Чтобы обнажить сердце, возьмитесь за левые ребра и отрежьте их кончики.

Теперь медленно введите в правый желудочек 0,1 миллилитра гепарина После инъекции отрежьте остальные ребра. Используйте задний или закругленный конец щипцов, чтобы аккуратно оттолкнуть легкие от ребра, разрезая ребра под микроскопом. Удалите железистую ткань в жировой клетчатке на верхней части сердца.

С помощью пинцета оторвите салфетки и обрежьте их. С помощью пружинных ножниц наложите шов вокруг аорты и легочной артерии, аккуратно проткните сердце тупым пинцетом. Сопротивление должно быть небольшим.

Теперь завяжите свободный шов двойным пледом. Далее отрежьте нижнюю часть живота. Используйте наклонные ножницы, чтобы разрезать ребра и позвоночник.

Это приведет к тому, что будет вытекать значительное количество крови. Используйте ватную палочку, чтобы остановить поток. Как только кровоток будет остановлен, введите в систему IL четыре миллилитра RPMI из шприца, наполненного 10 миллилитрами RPMI.

Хорошо еще раз проверить, не содержит ли трубка пузырей. Теперь канюлялизируйте правый желудочек, вырезав небольшую выемку возле верхушки и вставив канюлю вниз вправо, чтобы добраться до легочной артерии. Кончик зонда должен быть виден через почти прозрачную стенку легочной артерии.

Затем затяните шов вокруг канюли, аорты и легочной артерии, чтобы канюлировать левый желудочек. Вырежьте выемку на вершине и вставьте канюлю направленным вверх в левое предсердие. Может потребоваться небольшое давление, чтобы найти клапан, но как только он будет найден, канюля проскользнет и будет надежно защищена без швов.

Вручную вводите RPMI из 10-миллилитрового шприца со скоростью 0,3 миллилитра в минуту, пока не увидите поток в отводящей трубке. Если в трубке оттока нет потока, измените положение канюли левого желудочка. Однако, если в легких нет потока, прервите эксперимент, потому что в легочной артерии, скорее всего, есть утечка.

Теперь, когда сердце полностью канюлировано, подключите шприц объемом 60 миллилитров к системе IL one. С помощью насоса с постоянным потоком и вливанием RPMI Perfuse eight со скоростью один миллилитр в минуту. Проверьте наличие утечек во время первичной перфузии.

Постепенно перфузируйте легкие еще две минуты, за это время легкие станут белыми. Для исследований пульсирующего потока. Сначала установите смещение поршня одиночного насоса на нужных уровнях.

Затем установите постоянный расход. Теперь откройте клапан насоса osli и начните запись данных непосредственно перед запуском профиля потока osli. Когда все будет готово, откройте файл вывода данных и постройте график экспериментального потока на основе экспериментальных потоков из первоначального испытания.

Отрегулируйте смещение поршня колебательного насоса на каждой частоте так, чтобы Q max был нужным. Поддерживайте постоянное давление вентиляции Во время сбора данных для испытаний установившегося потока закройте клапан для одиночного насоса и установите постоянный расход на желаемом уровне. Начните запись данных и пошагово пройдите через протокол стабильного потока.

Сбор данных в течение не менее 10 секунд При каждой скорости потока между испытаниями. Сбросьте скорость потока до 0,5 миллилитров в минуту. Обязательно поддерживайте постоянное давление вентиляции во время сбора данных.

Если требуется нулевое давление в левом предсердии, удалите трубку оттока во время проведения испытаний. Внимательно следите за RPMI в трубках дыхательных путей. Нельзя допускать попадания RPMI на датчики давления в дыхательных путях, иначе они будут повреждены.

Ниже приведены результаты перфузии с устойчивым потоком Q в верхнем ряду и результирующим давлением в легочной артерии и левом предсердии во втором ряду при различных условиях. На первых двух панелях давление в левом предсердии увеличивалось и уменьшалось с Q, потому что трубка оттока была на месте, первая панель показывает давление воздуха в конце, давление вдоха, а вторая показывает давление воздуха в конце выдоха. Затем трубка удалялась таким образом, чтобы давление в левом предсердии было постоянным и независимым от Q. Затем высота выходной трубки регулировалась вручную, чтобы давление в левом предсердии было выше.

Но независимо от Q, первая панель показывает давление воздуха в конце, давление на вдохе, а вторая показывает давление воздуха в конце. Давление выдоха. Результирующие устойчивые соотношения давления в легочной артерии для каждого случая могут быть получены путем построения графика зависимости давления от потока.

Вот результаты перфузии пульсирующего потока с потоком Q в верхней панели и результирующим давлением легочной артерии, левого предсердия и воздуха. На нижней панели. Исходя из этих пульсирующих соотношений легочного давления, можно рассчитать легочно-сосудистый импеданс, который отражает общую постнагрузку правого желудочка.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 20-30 минут. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не торопиться и расслабиться, чтобы ваши руки были неподвижны. Как только легкие будут адекватно перфузированы, трудная часть закончится.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как гистологический или биохимический анализ легочной ткани, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие молекулярные механизмы ответственны за наблюдаемые изменения в соотношениях потока пульсирующего давления в легких. Этот метод открывает путь исследователям в области физиологии легких к изучению роли конкретных генов и белков в развитии и прогрессировании легочных сосудистых заболеваний с использованием генетически модифицированных мышей.