Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы подготовить Driss Pupi к визуализации живых клеток делящегося предшественника сенсорного органа грудной клетки или SOP во время метаморфоза. Это достигается путем предварительной настройки соответствующего генетического скрещивания для получения потомства пюи для визуализации живых клеток. Вторым этапом процедуры является сбор оп пуи на соответствующем этапе для визуализации асимметрично делящихся нервных клеток-предшественников.

Третьим этапом процедуры является снятие зрачкового корпуса, чтобы установить куколку для визуализации. Заключительным этапом процедуры является установка куколки между предметным стеклом и покровным стеклом и переход к визуализации живых клеток. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают динамику флуоресцентно меченых белков во время асимметричного деления клеток клеток дикого типа или мутантных сенсорных органов с помощью эпифлуоресценции или конфокальной микроскопии.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как иммуногистохимия, заключается в том, что динамику белка можно отслеживать в режиме реального времени и в течение нескольких часов в неповрежденной пипе через нужную линию gal four и слитый белок, помеченный GFP. Под контролем БАС выявляют пюи, которые подверглись воздействию в течение часа. Эти пюи будут обладать характерной морфологией зрачков, но не будут иметь пигментации.

Выбранный пуй можно либо перенести в свежий файл, либо отметить на перекрестном файле, чтобы запомнить, какие из них были белыми. Через 18 часов, когда пучок достигнет соответствующей стадии, поместите кусок двустороннего скотча на предметное стекло микроскопа и приклейте зрачковый футляр к предметному стеклу вентральной стороной вниз под препарирующим микроскопом. Определите и возьмитесь за край УРМ с помощью пары щипцов и осторожно приподнимите, обнажив голову неполовозрелой мухи.

Будьте осторожны, чтобы не проколоть тело мухи. Аккуратно оторвите боковую часть зрачка и снимите ее полностью, чтобы обнажить грудную клетку и переднюю часть живота. Продолжайте осторожно отрывать ту же сторону в сторону задней и потяните чехол зрачка на противоположную сторону и приклейте его к ленте.

Теперь, когда живот полностью обнажен, осторожно протолкните щетку с мягкой щетиной под головку куколки и поднимите ее от остальной части зрачка. Поместите куколку на предметное стекло микроскопа тыльной стороной вверх Расположите куколку под углом 45 градусов так, чтобы защитное стекло касалось области клеток грудной клетки СОП. Сначала сделайте квадратную рамку 18 на 18 миллиметров из фильтровальной бумаги Ватмана, вырезав в центре окно 10 на 10 миллиметров.

Погрузите каркас в воду до полного насыщения, а затем поместите вокруг куколку. С помощью шприца объемом пять куб. см нанесите равномерный слой силиконовой смазки вокруг рамы таким образом, чтобы толщина слоя была лишь немного больше диаметра зрачка. Нанесите пипеткой примерно один микролитр воды на центр защитного колпачка размером 22 на 22 миллиметра и расположите защитный колпачок таким образом, чтобы капля касалась узла зрачка.

Осторожно надавите, чтобы образовалась полная герметизация и плоская поверхность на куколке. Теперь, когда живая куколка установлена, ее можно визуализировать с помощью конфокальной микроскопии, комбинируя методы вскрытия и монтажа. С помощью визуализации в реальном времени можно визуализировать накопление гибридного белка GFP актина в борозде расщепления митотической клетки SOP.

Со временем распределение партнеров Num RFP и RAB 5G FP можно сравнить по двум дочерним ячейкам SOP. Обратите внимание, что в то время как партнер NUM RFP распределен асимметрично, RAB 5G FP равномерно распределен в обеих клетках на поздних стадиях зрачка. Дифференцированные внешние органы чувств могут быть визуализированы: менос, сенсорные впадины и волоски проявляют аутофлуоресценцию и показаны здесь перекрывающимися с L-G-L-G-F-P, экспрессируемыми в подмножестве клеток СОП.

Использование системы Markem После освоения этой техники можно выполнить менее чем за 10 минут, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как идентификация сульфатов клеток сенсорных органов со специфическими маркерами антител или исследование колокализации гибридных белков GFP с эндогенными белками.