В естественных условиях лазерной Axotomy на языке C. Элеганс

Общая цель данной процедуры заключается в точном перерезании нейронов CL лазером in vivo. Это достигается путем сборки системы для таксотомии, а также точной фокусировки, юстировки и настройки мощности лазера. Когда черви иммобилизованы на предметном стекле микроскопа, их нейроны можно перерезать с точным пространственным и временным контролем.

Степень регенерации перерезанных нейронов затем измеряют путем подсчета конусов роста и/или путем измерения длины нейритов. Главным преимуществом этого метода перед существующими, такими как фемтосекундный лазер, является то, что микроточечный импульсный лазер представляет собой экономичную систему, которая проста в установке и обслуживании и легко адаптируется для самых разнообразных применений; хотя обычно мы применяем этот метод для изучения регенерации ГАМК-эргических моторных нейронов. Система также может быть использована для абляции других типов клеток, таких как клетки кожи, мышц или специфических нейронных синапсов.

Данный метод требует наличия лазерной системы с микрофокусировкой. Лазер устанавливается в порт эпифлуоресцентной освещенности комбинированного микроскопа и включает в себя один дихроичный фильтр, соответствующий флуорофору в клетках, подлежащих разрезанию, генератор импульсов и ножную педаль для управления лазером. Минимальная комплектация микроскопа должна включать объектив с увеличением 100-крат и числовой апертурой 1.4 NA для иммерсионного масляного метода, а также объектив с увеличением 4-крат.

Используйте моторизованный предметный столик с управлением с помощью джойстика, установленный на пневматическом столе для обеспечения стабильности освещения. К микроточечному лазеру присоединен источник света со световодом и затвором. Механизм затвора позволяет снижать интенсивность освещения независимо от работы лазера.

Камера, подключенная к компьютеру, должна иметь частоту кадров не менее 16 Гц и стабильно работать в условиях пониженной освещенности. На компьютере должно быть установлено программное обеспечение для обработки изображений, такое как Nikon elements, для визуализации нейронов, управления камерой и манипулирования моторизированным предметным столиком. После полной сборки пользователь может одной рукой фокусировать микроскоп, другой — перемещать столик, активировать лазер с помощью ножной педали и при этом четко видеть изображение на экране.

Разрез нейронов в организме размером с песчинку может быть сложной задачей. Для этого лазер должен быть точно сфокусирован во всех трех измерениях. Начните с фокусировки плоскости Z.

Вставьте нейтральный светофильтр ND 16 для ослабления лазерного излучения при предварительной фокусировке, затем установите как ND 16, так и четыре флуоресцентных фильтра ND. Затем с помощью переключателя выберите режим одного импульса для микроточечного лазера и поверните колесо фильтров, чтобы установить соответствующий длинноволновый барьерный фильтр. Поместите зеркальное стекло на предметный столик и сфокусируйтесь на имеющихся в нем отверстиях, используя объектив с четырехкратным увеличением и проходящий свет.

После настройки фокуса нанесите каплю иммерсионного масла на предметное стекло и снова сфокусируйтесь на перфорациях, используя объектив с 100-кратным увеличением. Затем с помощью рычага переключения оптического пути откройте затвор камеры и затвор лазера. Если добиться точной фокусировки затруднительно, уменьшите интенсивность проходящего света, чтобы края перфораций стали четкими.

Для проверки фокусировки используйте ножную педаль для срабатывания лазера. Если плоскость Z сфокусирована правильно, в зеркале должно появиться маленькое отверстие. Теперь сфокусируйте микроскоп чуть выше плоскости предметного стекла с зеркальным напылением и снова активируйте лазер.

В результате этого должно образоваться отверстие еще меньшего размера, чем при первом облучении, или же не остаться никаких следов. Аналогичные результаты должны наблюдаться при фокусировке под зеркальным предметным стеклом. Однако, если образуется отверстие большего размера, необходимо заново сфокусировать лазер с помощью кольца фокусировки на абляционной головке.

Наконец, убедитесь, что отверстие по-прежнему правильно совмещено с перекрестием в окуляре. При регулярном использовании фокусировку по плоскости Z требуется корректировать редко. Для фокусировки лазера в плоскости XY сделайте еще одно отверстие в зеркале, а затем перейдите к соответствующему разделу программного обеспечения в Nikon elements.

Запустите режим захвата в реальном времени в меню захвата (acquire). На панели инструментов измерения выберите редактор ROI, выберите инструмент «двойной перекрестие» и перетащите перекрестие так, чтобы оно совместилось с центром нового отверстия. Нажмите «сохранить ROI», а затем «выход из редактора», чтобы вернуться к захвату в реальном времени.

Чтобы управлять предметным столиком с помощью мыши, активируйте настройку XY для мыши. Теперь лазер сфокусирован. Верните нейтральные светофильтры в исходное положение и установите количество импульсов лазера от 1 до 10 для дальнейшего использования.

Сначала приготовьте раствор 3% расплавленного агароза в растворе M9 и перенесите примерно 5 мл в пробирку объемом 50 мл. Поместите пробирку в водяную баню при температуре от 55 до 65 °C, а оставшуюся часть раствора сохраните для дальнейшего использования. Теперь возьмите два предметных стекла с нанесенной маркировкой.

Прикрепите скотчем пару чистых предметных стекол и нанесите каплю агарозы, чтобы создать подушечку, на которую будут помещены черви. Через 30 секунд агароза застынет; с помощью пипетки нанесите от 3 до 5 µL полистирольных микросфер размером от 0,05 до 0,1 мкм на подушечку. В течение 10 минут аккуратно перенесите с помощью платинового зонда от 5 до 10 трансгенных червей на микросферы так, чтобы их меченые нейроны были хорошо видны. Чтобы не повредить червей, осторожно накройте их стандартным покровным стеклом.

Перемещайте препарат. Теперь предметное стекло с червями готово к проведению таксономического анализа. Используя окуляр, найдите червей при четырехкратном увеличении, перефокусируйте с объективом 100х, выключите проходящий свет, включите флуоресценцию и переключите оптический путь на камеру.

С помощью мыши центрируйте нейрон по перекрестию. Теперь активируйте лазер нажатием ножной педали. При правильной мощности лазера нейрон будет пересечен за один или два импульса.

Слишком высокая мощность лазера приведет к периферическим повреждениям или прожгу отверстия в черве; для регулировки мощности лазера переместите пластину аттенюатора. Если мощность лазера снизится, положение пластины аттенюатора можно отрегулировать для продолжения резки. Однако это, вероятно, указывает на необходимость замены элемента питания в D-отсеке лазера, когда процедура выполняется правильно.

Лазерная таксотомия вызывает небольшой разрыв нейрона. В некоторых случаях вокруг места повреждения может образоваться небольшой рубец. На практике у одного животного перерезают от одного до трех нейронов, однако теоретического ограничения не существует.

По завершении извлеките червей, подняв покровное стекло строго вертикально вверх, следя за тем, чтобы черви остались на подложке из агарозного геля. Не сдвигайте покровное стекло. С помощью остроконечного пинцета вырежьте фрагмент подложки с червями.

Поместите подложку на свежезасеянную чашку с NGM, содержащую OP 50, и освободите червей, добавив 10 µL стерильного раствора M9. Спустя 8–48 часов после экзотомии можно оценить регенерацию; для этого зафиксируйте здоровых червей на 3–5 µL полистирольных микросфер и визуализируйте нейроны в местах разрыва. Дистальнее места разреза останется нейрональный пенек. Как дистальный, так и проксимальный пеньки изначально сокращаются после разреза, однако регенерация ожидается со стороны проксимального пенька.

Регенерацию можно оценивать по формированию конуса роста. В качестве альтернативы можно отслеживать и сравнивать длину нейритов; обычно от 60 до 70% ГАМК-ергических нейронов формируют конусы роста в течение 24 часов после пересечения. Если лазер режет неправильно, скорее всего, это происходит либо из-за расфокусировки лазера, либо из-за необходимости замены красителя в кювете с красителем.

Кроме того, если вы заметили, что черви перемещаются, это, вероятно, связано с избыточной влажностью подушечки агарозы. Мы обнаружили, что для решения этой проблемы подушечки следует оставить примерно на 30 секунд перед тем, как помещать на них червей. Кроме того, для иммобилизации червей можно попробовать использовать микросферы меньшего размера.

Наконец, если вы заметили, что аксоны выглядят как бусины, скорее всего, это произошло из-за того, что подушечка из агарозы слишком сухая. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как настроить систему микроточечного лазера, зафиксировать червей для таксотомии, перерезать отдельные нейроны и оценить последующую регенерацию.