Инъекции инсулина и гемолимфы добычи для измерения чувствительности к инсулину у взрослых Дрозофилы

Общая цель этой процедуры заключается в измерении влияния введенного инсулина на уровень глюкозы в лимфе у взрослых дрозофил мелан гастер. Это достигается путем предварительного разрешения голодающим мухам глотать концентрированный раствор глюкозы. Вторым этапом процедуры является введение инсулина мухам, которых кормили глюкозой.

Третьим этапом процедуры является сбор незагрязненного образца гемолимфы. Заключительным этапом процедуры является определение концентрации глюкозы в лимфе гемо. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают, что экзогенный инсулин способствует клиренсу глюкозы в гастере Esof la Melan с помощью спектрометрии.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами обезглавливания у взрослых, заключается в том, что эта процедура минимизирует содержимое кишечника. Загрязнение образца лимфы Hema Collect мух в течение 24 часов после окклюзии путем их обезболивания с использованием увлажненного углекислого газа. Отсортируйте самок мух и поместите их во флаконы со стандартным рационом.

Дайте мухам состариться в течение 10 дней. Через 10 дней переложите мух во флаконы, содержащие пятимиллилитровую пробку 2%aros, и морите их голодом в течение 12-16 часов. Переложите голодавших мух во флаконы, содержащие 10% пропитанную глюкозой фильтровальную бумагу, за один час до инъекции инсулина, чтобы раствор инсулина для инъекций растворил бычий инсулин в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 0,01 мг на миллилитр.

Также приготовьте контрольный раствор, содержащий только PBS. Добавьте синий пищевой краситель в растворы инсулина и контрольные растворы до конечной концентрации 0,5% и держите оба раствора на льду на протяжении всей процедуры. Притупите кончики только что выдернутых стеклянных игл, продавив их через салфетку Кима.

Чтобы создать толстый кончик с большим плохим диаметром, поместите затупленные иглы в микропробирку, содержащую либо инсулин, либо контрольный раствор, и позвольте капиллярному действию заполнить иглы. Проверьте каждую иглу на наличие пузырьков под стереомикроскопом и выбросьте те, которые не заполнились чисто. Вставьте заполненные иглы в ручной иглодержатель микроинъектора и расположите держатель с помощью микром-манипулятора так, чтобы кончик иглы был виден через стереомикроскоп.

Надавите положительным давлением на столб жидкости в игле, повернув микрометрическую ручку, прикрепленную к поршню на шприце микроинжектора. Прикоснитесь химическими салфетками к кончику иглы, чтобы убедиться, что давление достаточна для потока жидкости. После того, как игла будет подготовлена к инъекции, зафиксируйте калибровочную таблицу на стержне иглы с помощью прозрачной ленты и сфокусируйте кончик иглы через стереомикроскоп с 20-кратным увеличением.

Кратковременно обезболите мух, которых кормили глюкозой, увлажненным углекислым газом и положите их на подушку на льду для продолжения анестезии под стереомикроскопом. Возьмите мушку с помощью пары тонких щипцов и держите ее близко к игле так, чтобы кончик примыкал к передней области левой стороны мухи. В области грудной клетки сфокусируйтесь как на кончике иглы, так и на грудной клетке мухи.

Осторожно переместите мушку к кончику иглы так, чтобы кончик иглы коснулся центра выпуклости левой предыдущей области мушки. Грудная клетка продолжает продвигаться мушкой на иглу так, чтобы игла пронзила центр предположения. Приложите положительное давление, продвигая поршень шприца с помощью ручки микроинжектора, микроманипулятора до 0,1.

Микролитр либо раствора инсулина, либо контрольного раствора был введен мухе. Инъекция придаст голубой цвет левой стороне передней грудной клетки. Дайте введенным мухам восстановиться в файлах 2%Aros в повторяющихся группах за ноль, 15 и 30 минут до извлечения гемолимфы закрепите кусок двустороннего скотча на углекислой подушке на время.

Нулевую группу обезболивают мух и располагают их на ленте спинной стороной вниз ровными рядами с выровненными головными капсулами. После того, как мухи будут закреплены на ленте, возьмите муху pro bois тонкими щипцами и осторожно потяните ее к вентральной, а затем задней области так, чтобы была видна передняя часть капсулы головы. Удерживая пробос в нужном положении, проколите капсулу головки над лентальным швом с помощью острой вольфрамовой иглы, стараясь не проколоть головку целиком.

После того, как все мухи будут проколоты, используйте обрезанную деревянную палочку-аппликатор, чтобы мягко надавить на брюшко мухи. При этом образуется небольшая капелька гемолимфы в месте прокола капсулы головы. Прикоснитесь концом микрокапиллярной трубки объемом в один микролитр к гемокапле лимфы.

Определите и запишите количество собранной гемолимфы путем сверки столба жидкости в микрокапиллярной трубке с градуированной диаграммой объема с помощью спектрофотометра, определите абсорбцию на 340 нанометрах и определите концентрацию глюкозы, в то время как у мух, которым вводили раствор бычьего инсулина, наблюдалось снижение уровня глюкозы в лимфе хамо через 15 и 30 минут после инъекции по сравнению с контрольным раствором для введенных мух. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно вводить небольшие объемы раствора взрослой дрозофиле. Как извлечь гемолимфу из взрослой дрозофилы и как определить концентрацию глюкозы в гемолимфе из взрослой дрозофилы после этой процедуры.

Другие эксперименты, такие как концентрация белка, определение и определение концентрации триглицеридов гемолимфы, могут быть проведены, чтобы ответить на такие вопросы, как: как инсулин влияет на связанные аспекты метаболизма питательных веществ у взрослых дрозофил?