Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

В этом видео демонстрируется метод культивирования и дозирования флуоресцентных штаммов CL gans для высокопроизводительного скрининга химических библиотек или обнаружения загрязнителей окружающей среды для оценки влияния химических веществ или агентов окружающей среды на определенную активность белка. В CL elgan бактериальные культуры сначала готовятся в пищу для червей и трансгенных GFP. Синхронизированные черви культивируются.

Затем от 0,5 до 2 миллионов червей собирают, промывают и распределяют в 3 84 штуки. Ну, микротитровальные планшеты, затем небольшие молекулы из химической библиотеки или тестовых образцов, таких как вода, пища или почва, добавляются к червям. Наконец, флуоресценция червей измеряется с помощью считывателя микропланшетов.

Анализ данных интенсивности флуоресценции позволяет выявить малые молекулы, которые модулируют индуцируемые транскрипционные пути или позволяют обнаруживать загрязнители окружающей среды. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как анализы in vitro и на основе клеточных культур, заключается в том, что время не будет потрачено впустую на соединения, которые являются токсичными или неактивными in vivo. Этот высокопроизводительный метод может помочь идентифицировать малые молекулы, которые модулируют различные индуцируемые пути.

Несмотря на то, что мы разработали этот метод для высокопроизводительного скрининга библиотек малых молекул, он также может быть применен для биосенсорного анализа загрязняющих веществ в образцах продуктов питания и окружающей среды. Демонстрировать процедуру будет Эндрю Дайн, техник моей лаборатории, и Q Long, постдок моей лаборатории. Заранее приготовьте корм для бактериальных червей.

Начните с инокуляции 500 миллилитров потрясающего бульона, дополненного 50 микрограммами на миллилитр стрептомицина пятью миллилитрами насыщенной кишечной палочки. ПОСТАНОВЛЯЮЩАЯ ЧАСТЬ 50. Поместите культуру на шейкер и выращивайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день разделите культуру на 10 пробирок по 50 миллилитров. Затем поместите пробирки в охлаждаемую центрифугу и вращайте при температуре 2 500 RCF в течение 20 минут. После отжима Резуса суспензируйте каждую бактериальную гранулу в 10 миллилитрах жидкой нематоды питательной среды или НГМ.

Встряхните суспензии горизонтально. Встряхиватель для пола на 15 минут для ресуспендирования бактерий. Затем центрифугируйте бактериальную культуру при температуре 2500 RCF при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Сцедите NGM и взвесьте бактериальную гранулу. Затем добавьте равный объем буфера NGM и повторно суспендируйте гранулы путем вортексирования. Наконец, распределите три миллилитра ресуспендированной бактериальной культуры в 15-миллилитровые пробирки и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся.

В этой демонстрации в качестве примера будет измерено влияние напряжения, индуцирующего кредит Xeno Duke, на транскрипционный фактор Sskn one. Известно, что Sskn one активирует цитопротекторные гены во время окислительного и ксенобного стресса. Получена крупномасштабная культура линии Trenchgenic c gans VP 5 96, которая несет две флуоресцентные конструкции.

Черви VP 5 96 экспрессируют оба промотора GST 4, управляющего GFP, который используется для мониторинга активности транскрипционного фактора. Sskn один и DOP три промоутер за рулем. RFP используется в качестве стандарта для нормализации численности червей.

DOP 3 является промотором дофаминового рецептора и конститутивно экспрессируется в нейронах по всему телу. В приведенном примере, учитывая, что ксеноби лон сильно активирует sskn one и увеличивает количество GFP, экспрессируемого промотором GS T 4, для приготовления культур начинают с объединения 150 миллилитров буфера N NGM, 1,5 миллилитров LB 150, микролитров одного молярного холестерина и 75 микролитров 100 миллиграммов на миллилитр. Стрептомицин. Добавление LB помогает предотвратить прилипание червей к стеклянной и пластиковой посуде, но этого количества недостаточно для поддержания роста бактерий.

Процедите для стерилизации смеси, затем переложите ее в стерильную литровую колбу и отставьте колбу в сторону, чтобы освободить яйца от взрослых червей GR. Промойте бактерии от червей, центрифугируя их и заменяя среду NGM до тех пор, пока супинат не станет прозрачным. Промойте червей во второй раз с помощью Resus, снова подвесив их в центрифуге в стерильной воде после отжима.

Снимите супинат и наполните трубку 3,75 миллилитрами стерильной воды. Добавьте один миллилитр бытового отбеливателя и 250 микролитров 10 нормальных гидроксидов натрия, смешанных сразу путем инверсии пять-шесть раз. Поместите трубку во вращатель после того, как черви подверглись воздействию отбеливателя в течение четырех минут.

Поместите трубку под стереомикроскоп. Большая часть взрослых должна быть ложью. Энергично встряхните трубку от 15 до 20 раз, чтобы помочь оставшимся взрослым червям после проведения лизиса в общей сложности на пять минут, добавьте стерильную воду, пока трубка не заполнится.

Перемешайте путем инверсии пять-шесть раз, чтобы собрать яйца. Центрифугируйте пробирку в течение одной минуты при температуре 500 RCF. Вымойте яйца трижды Ресусом, согнув их в 10 миллилитрах стерильной воды, откручивая и удаляя супинат.

Далее разведите 100 микролитров образца яиц в 100 раз, добавив 10 миллилитров буфера NGM. Затем пипеткой нанесите три пятилитровые аликвоты на крышку чашки Петри под микроскопом. Посчитайте количество яиц в трех отдельных аликвотах по пять микролитров.

Для оценки общего количества яиц. Добавьте от 200 000 до 2 миллионов яиц в колбу с буфером NGM и встряхните культуру при 100 об/мин при 20 градусах Цельсия. Не менее чем через 16 часов после добавления яиц в колбу с помощью стерильной серологической пипетки удаляют примерно 0,5 миллилитра культуры взвешенных червей.

Пипетка три, пять микролитров каплей на стерильную крышку чашки Петри. Поместите крышку в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов на одну-две минуты, чтобы парализовать червей после того, как черви будут парализованы. Подсчитайте среднее количество живых вылупившихся червей на пять микролитров с помощью стереомикроскопа, чтобы оценить общее количество.

Разморозьте подготовленную ранее замороженную бактериальную культуру ОП 50, поставив ее на скамейку на несколько минут. Затем добавьте три миллилитра 50%OP 50 на 500 000 вылупившихся червей. Встряхните колбу со скоростью 100 об/мин при температуре 20 градусов Цельсия.

Черви разовьются в личинки L, четыре и молодые взрослые особи примерно за 51 час. Следите за количеством бактерий на протяжении всей инкубации путем визуального осмотра. Добавьте больше бактерий, если среда станет прозрачной.

С помощью стерильной серологической пипетки перенесите примерно 0,5 миллилитра культуры взвешенного червя в стандартный агаровый планшет NGM. Посмотрите на червей с помощью стереомикроскопа, чтобы убедиться, что большинство из них являются личинками L четырех и молодыми особями при светлопольной микроскопии, L четыре личинки будут иметь вентральное чистое пятно в середине тела. Молодые особи будут немного крупнее и не будут иметь четкого пятна.

Далее вытяните культуру червей в стерильные пробирки объемом 50 миллилитров. Поместите пробирки в штатив для пробирок в колпаке и дайте им осесть невылупившимся яйцам или неразвивающимся червям. Селятся медленнее, чем развившиеся черви.

Через 10 минут удалите супинат, который содержит невылупившихся и неразвившихся червей, путем аспирации примерно 10 миллилитров буфера NGM на каждую гранулу и подвесьте червей, осторожно закручивая трубки. Соберите всех червей в одну 50-миллилитровую пробирку. Вращайте центрифугу с качающимся ведром при давлении 500 RCF в течение 30 секунд.

Затем повторно суспендируйте червей в 50 миллилитрах NGM с 1% фунтом, чтобы промыть их. Повторите это, промойте три-четыре раза, чтобы удалить бактерии после стирки. Заполните пробирку буфером NGM плюс LB до 50 миллилитров.

Налейте его в специальную колбу для дозирования червей на перемешивающей панели и поставьте на тарелку для перемешивания. Минимум около 20 миллилитров или 60 000 червей необходимо, чтобы заполнить мертвое пространство в раздаточной колбе и дозаторе-кассете. Посчитайте количество червей в трех каплях по пять микролитров, как показано ранее.

После подсчета при НГМ плюс ЛБ до концентрации от 12 до 15 червей на 5 микролитров капли каждые 3 84 лунки требуется около 35 000 червей или 11,5 миллилитров взвешенных червей. Загрузите в диспенсер дозатор 10 микролитров и простерилизуйте его, загрунтовав 70% этанолом. Промойте этанол, загрунтовав стерильной водой.

Вставьте конец дозирующей кассеты в колбу так, чтобы она находилась чуть выше мешалки, не нарушая ее движения. Следите за тем, чтобы черви оставались во взвешенном состоянии по всей колбе. Запрограммируйте дозатор на дозирование червей на низкой скорости с двумя предимпульсными заправками и запуском не менее 10 миллилитров взвешенных червей.

Быстро заполните микротитровальные планшеты, которые уже должны содержать исследуемые соединения, чтобы предотвратить оседание червей в трубке. Здесь требуется испытуемое соединение, предварительно загруженное на микротитровальную пластину. Светиться. Заклейте пластины дышащей лентой, чтобы предотвратить скопление пыли в колодцах.

Поместите планшеты на встряхивающую платформу в инкубаторе при температуре, подходящей для проведения анализа. Не складывайте пластины друг на друга, так как это может ограничить поток воздуха. Поместите целевую пластину в считыватель микропланшетов, чтобы измерить интенсивность флуоресценции каждой лунки с соответствующими длинами волн излучения и возбуждения.

Фильтры, используемые для GFP, имеют возбуждение на 4:85 и излучение на 5:28. Фильтры для RFP имеют возбуждение при пяти 40 и излучение при пяти 90. После прочтения показаний планшета рассчитать отношение GFP к RFP и нормализовать по показаниям контрольных лунок, которые не содержат активирующего соединения, определить точную кратную разницу интенсивности флуоресценции, полученную от отдельных обработок.

В показанном здесь анализе SSKN one используется хромосомно интегрированный двойной отчет, штамм, когда черви вручную подсчитывались с помощью стереомикроскопа. Количество червей коррелировало с объемом, полученным при значении R в квадрате 0,94 и значении p менее 0,0001. Это указывает на то, что количество червей, выдаваемых в каждую лунку, можно контролировать, регулируя выдаваемый объем.

На этих рисунках общая флуоресценция GFP на лунку, показанная слева, и флуоресценция RFP на лунку, показанная справа, хорошо воспроизводимы от скважины к скважине на планшете из 3 84 лунок. XS указывает на относительную флуоресценцию, измеренную в каждой лунке. Сплошными линиями обозначены средние значения, а прерывистыми линиями обозначены три стандартных отклонения выше или ниже среднего значения флуоресценции всех лунок с коэффициентом вариации ниже 9%. Как показано на этом рисунке, флуоресценция GFP от промотора GST four линейно коррелирует с флуоресценцией RFP от промотора DOP three в 3 84 лунках со значением R в квадрате 0,62 и значением p менее 0,0001.

Таким образом, для нормализации индуцируемого можно использовать неиндуцируемый репортер RFP. Репортер GFP. При выражении отношение GFP к RFP флуоресценция становится высоковоспроизводимой от скважины к скважине на планшете с 3 84 лунками.

Расчет отношения GFP к RFP снизил коэффициент вариации до уровня ниже 6%, продемонстрировав способность репортера DOP с тремя промоторами RFP снижать вариабельность, как показано здесь. Индукция GFP относительно RFP с помощью SK N, активирующего ксенобиотик, является надежной и высоковоспроизводимой на планшете с 3 84 лунками, средние относительные коэффициенты флуоресценции всех контрольных и обусловленных лунок GLO отмечены сплошными линиями. Три стандартных отклонения выше среднего контрольного и ниже среднего dlo отмечены ломаными линиями.

После того, как это будет освоено, запуск культивирования червей может быть выполнен примерно через час в первый день, а сбор и выдача могут быть произведены. А от червей можно провести около двух часов, если все сделать правильно. Несмотря на то, что при попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нужно начинать по меньшей мере с 60 000 червей и держать их в подвешенном состоянии во время дозирования, после чего можно провести скрининг с другими, например, отчетными строками для других индуцируемых путей, чтобы разработать модуляторы для других путей после ее развития.

Этот метод может проложить путь для исследователей в области высокопроизводительного скрининга и биосенсорики для быстрой идентификации модуляторов низкомолекулярных путей или обнаружения загрязнителей окружающей среды. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как культивировать, дозировать и измерять флуоресцентные штаммы элегана для высокопроизводительного скрининга индуцируемых транскрипционных путей или тестирования нескольких образцов на наличие загрязнителей окружающей среды.