Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

В данном видео демонстрируется метод культивирования и дозирования флуоресцентных штаммов C. elegans для высокопроизводительного скрининга химических библиотек или обнаружения загрязнителей окружающей среды с целью оценки влияния химических или экологических факторов на активность специфических белков. При работе с C. elegans сначала подготавливают бактериальные культуры в качестве корма для червей, после чего культивируют синхронизированных трансгенных червей, экспрессирующих GFP.

Затем собирают от 0,5 до 2 миллионов червей, промывают их и распределяют по трем 84-луночным микротитрационным планшетам, после чего к червям добавляют малые молекулы из химической библиотеки или исследуемые образцы, такие как вода, пища или почва. В завершение с помощью планшетного ридера измеряют флуоресценцию червей.

Анализ данных интенсивности флуоресценции позволяет выявить малые молекулы, которые модулируют индуцибельные транскрипционные пути или позволяют обнаруживать загрязнители окружающей среды. Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как анализы in vitro и на культурах клеток, заключается в том, что время не будет затрачено на соединения, которые токсичны или неактивны in vivo. Этот высокопроизводительный метод может помочь в идентификации малых молекул, модулирующих различные индуцибельные пути.

Хотя этот метод был разработан для высокопроизводительного скрининга библиотек малых молекул, он также может быть применен для биосенсорного анализа загрязнителей в пищевых и экологических пробах. Процедуру продемонстрируют Эндрю Дайн, техник моей лаборатории, и Кью Лонг, постдок моей лаборатории. Заранее подготовьте питательную среду для бактериальных червей.

Начните с инокуляции 500 миллилитров бульона Terrific Broth, дополненного стрептомицином в концентрации 50 микрограмм на миллилитр, пятью миллилитрами насыщенной культуры e coli. OP 50. Поместите культуру на шейкер и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия.

На следующий день разделите культуру по 10 пробиркам объемом 50 мл. Затем поместите пробирки в центрифугу с охлаждением и центрифугируйте при 2, 500 RCF в течение 20 минут. После центрифугирования ресуспендируйте каждый бактериальный осадок в 10 мл жидкой среды для выращивания нематод (NGM).

Перемешивайте суспензии по горизонтали. Используйте лабораторный шейкер в течение 15 минут для ресуспендирования бактерий. Затем центрифугируйте бактериальную культуру при 2 500 RCF при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут.

Слейте среду NGM и взвесьте бактериальный осадок. Затем добавьте равный объем буфера NGM и ресуспендируйте осадок с помощью вортекса. В завершение распределите по 3 мл ресуспендированной бактериальной культуры в пробирки объемом 15 мл и храните их при температуре -20 °C до использования.

В данном демонстрационном эксперименте в качестве примера будет измерено влияние стресса, индуцированного Xeno Duke loan, на транскрипционный фактор Sskn one. Известно, что Sskn one активирует цитопротективные гены при окислительном и ксенобиотическом стрессе. Подготавливается крупномасштабная культура линии Trenchgenic c gans VP 5 96, содержащая две флуоресцентные конструкции.

96 червяков VP 5 экспрессируют как промотор GST four, управляющий GFP, который используется для мониторинга активности фактора транскрипции Sskn one, так и промотор DOP three, управляющий RFP, который используется в качестве стандарта для нормализации количества червей.

DOP three является промотором дофаминового рецептора и конститутивно экспрессируется в нейронах по всему организму. В данном примере, учитывая, что ксенобиотик сильно активирует sskn one и увеличивает количество GFP, экспрессируемого с промотора GS T four, для подготовки культур начните с объединения 150 мл буфера N NGM, 1,5 мл LB, 150 мкл 1 M холестерина и 75 мкл стрептомицина в концентрации 100 мг/мл. Добавление LB помогает предотвратить прилипание червей к стеклянной и пластиковой посуде, но этого количества недостаточно для поддержания роста бактерий.

Профильтруйте смесь для стерилизации, затем перенесите ее в стерильную колбу объемом один литр и отставьте колбу, чтобы из взрослых особей GR выделились яйца. Удалите бактерии с червей путем центрифугирования и замены среды NGM до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Промойте червей второй раз, суспендировав их в стерильной воде, и снова центрифугируйте после завершения осаждения.

Удалите супернатант и наполните пробирку 3,75 миллилитрами стерильной воды. Добавьте один миллилитр бытового отбеливателя и 250 микролитров 10 нормального раствора гидроксида натрия, после чего немедленно перемешайте содержимое, перевернув пробирку пять-шесть раз. Поместите пробирку в ротатор после того, как черви выдерживались в отбеливателе в течение четырех минут.

Поместите пробирку под стереомикроскоп. Большинство взрослых особей должны быть лизированы. Энергично встряхните пробирку 15–20 раз, чтобы помочь лизировать любые оставшиеся взрослые черви; после завершения лизиса (общее время выдержки — пять минут) добавьте стерильную воду до заполнения пробирки.

Перемешайте содержимое путем пяти-шести инверсий, чтобы собрать яйца. Центрифугируйте пробирку в течение одной минуты при 500 RCF. Промойте яйца трижды, ресуспендируя их в 10 миллилитрах стерильной воды, центрифугируя и удаляя супернатант.

Затем разведите образец яиц объемом 100 µL в 100 раз, добавив 10 mL буфера NGM. После этого под микроскопом перенесите пипеткой три аликвоты по 5 µL на крышку чашки Петри. Подсчитайте количество яиц в трех отдельных аликвотах по 5 µL.

Для оценки общего количества яиц добавьте от 200 000 до 2 миллионов яиц в колбу с буфером NGM и перемешивайте культуру при 100 RPM при 20 °C. Минимум через 16 часов после добавления яиц в колбу используйте стерильную серологическую пипетку, чтобы отобрать примерно 0,5 мл суспензии культуры червей.

Пипеткой нанесите три капли по 5 µL на стерильную крышку чашки Петри. Поместите крышку в морозильник при температуре -20 °C на одну-две минуты до полного паралича червей. После паралича червей с помощью стереомикроскопа подсчитайте среднее количество живых вылупившихся особей на 5 µL для оценки общего числа.

Разморозьте ранее подготовленную замороженную бактериальную культуру OP 50, оставив ее на лабораторном столе на несколько минут. Затем добавьте три миллилитра 50% OP 50 на 500 000 вылупившихся червей. Встряхивайте колбу со скоростью 100 RPM при 20 °C.

Черви разовьются до стадии личинок L4 и молодых взрослых особей примерно через 51 час. В течение всего периода инкубации контролируйте количество бактерий путем визуального осмотра. Добавьте больше бактерий, если среда станет прозрачной.

Используя стерильную серологическую пипетку, перенесите примерно 0,5 миллилитра суспензии культуры червей на стандартный агаризованный среду NGM. Осмотрите червей с помощью стереомикроскопа, чтобы убедиться, что большинство из них находятся на стадии личинок L4 или являются молодыми взрослыми особями; при микроскопии в светлом поле личинки L4 будут иметь прозрачное пятно на вентральной стороне в средней части тела. Молодые взрослые особи будут немного крупнее, и прозрачное пятно у них будет отсутствовать.

Затем перенесите культуру червей в стерильные пробирки объемом 50 миллилитров. Поместите пробирки в штатив в вытяжном шкафу и дайте осесть невылупившимся яйцам или недоразвившимся червям. Они оседают медленнее, чем развитые черви.

Через 10 минут удалите супернатант, содержащий невылупившихся и неразвитых червей, путем аспирации, затем добавьте примерно 10 миллилитров буфера NGM к каждому осадку и ресуспендируйте червей, осторожно вращая пробирки. Соберите всех червей в одну пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте в центрифуге с ротором с поворотными стаканами при 500 RCF в течение 30 секунд.

Затем ресуспендируйте червей в 50 миллилитрах NGM с 1%lb для их промывки. Повторите эту процедуру, промыв три-четыре раза, чтобы удалить бактерии после промывки. Долейте в пробирку буфер NGM плюс LB до объема 50 миллилитров.

Перелейте эту суспензию в специальную колбу для дозирования червей с магнитной мешалкой и установите ее на магнитную перемешивающую пластину. Для заполнения мертвого объема дозирующей колбы и дозирующей кассеты потребуется минимум около 20 milliliters или 60 000 червей. Подсчитайте количество червей в трех каплях по 5 µL, как было показано ранее.

После подсчета при выращивании на среде NGM с добавлением LB до концентрации 12–15 червей на каплю объемом 5 µL, для каждого 384-луночного планшета потребуется около 35 000 червей или 11,5 mL суспензии червей. Установите в диспенсер дозирующую кассету объемом 10 µL и стерилизуйте ее путем промывки 70% этанолом. Удалите остатки этанола, промыв систему стерильной водой.

Вставьте конец дозирующей кассеты в колбу так, чтобы она находилась непосредственно над магнитной мешалкой, не препятствуя ее вращению. Убедитесь, что черви остаются во взвешенном состоянии по всему объему колбы. Запрограммируйте диспенсер на выдачу червей на низкой скорости с двумя предварительными импульсами для промывки и пропустите не менее 10 milliliters суспензии с червями.

Быстро заполните микротитровальные планшеты, в которых уже должны находиться исследуемые соединения, чтобы предотвратить оседание червей в трубках. На этом этапе используются исследуемые соединения, предварительно внесенные в микротитровальный планшет. Glow. Загерметизируйте планшеты воздухопроницаемой лентой, чтобы предотвратить попадание пыли в лунки.

Поместите планшеты на встряхивающую платформу в инкубатор при температуре, соответствующей условиям анализа. Не складывайте планшеты друг на друга, так как это может ограничить поток воздуха. Поместите исследуемый планшет в микропланшетный ридер для измерения интенсивности флуоресценции в каждой лунке при соответствующих длинах волн возбуждения и эмиссии.

Для GFP используются фильтры с возбуждением на 485 и эмиссией на 528. Для RFP используются фильтры с возбуждением на 540 и эмиссией на 590. После считывания планшета вычислите отношение GFP к RFP и нормализуйте его по показаниям контрольных лунок, не содержащих активирующее соединение, чтобы определить точную кратность различия интенсивности флуоресценции, вызванную отдельными вариантами обработки.

В представленном здесь анализе SSKN используется штамм с хромосомно интегрированным двойным репортером, при котором черви подсчитывались вручную с помощью стереомикроскопа. Количество червей коррелировало с объемом дозирования с коэффициентом детерминации R² равным 0,94 и значением p менее 0,0001. Это указывает на то, что количество червей, дозированных в каждую лунку, можно контролировать, регулируя объем дозирования.

Суммарная флуоресценция GFP на лунку (слева) и флуоресценция RFP на лунку (справа), представленные на этих рисунках, характеризуются высокой воспроизводимостью между лунками в пределах планшета на 384 лунки. XS обозначают относительную флуоресценцию, измеренную в каждой лунке. Сплошные линии указывают средние значения, а пунктирные линии — три стандартных отклонения выше или ниже среднего значения флуоресценции всех лунок, при этом коэффициент вариации составлял менее 9%. Как показано на этом рисунке, флуоресценция GFP от промотора GST4 линейно коррелирует с флуоресценцией RFP от промотора DOP3 в 384 лунках со значением R² 0,62 и p-значением менее 0,0001.

Таким образом, неиндуцибельный RFP-репортер может быть использован для нормализации индуцибельного GFP-репортера. При таком подходе отношение флуоресценции GFP к RFP становится высоковоспроизводимым от лунки к лунке на планшете с 384 лунками.

Расчет соотношения GFP к RFP позволил снизить коэффициент вариации до значения менее 6%, что демонстрирует способность репортера RFP с тремя промоторами DOP снижать вариабельность, как показано здесь. Индукция GFP относительно RFP при воздействии активирующего ксенобиотика SK N one является стабильной и высоковоспроизводимой по всему 384-луночному планшету; средние значения относительных коэффициентов флуоресценции для всех контрольных лунок и лунок с due GLO отмечены сплошными линиями. Три стандартных отклонения выше среднего значения контроля и ниже среднего значения dlo отмечены пунктирными линиями.

После освоения метода запуск культуры червей занимает около одного часа в первый день; сбор и распределение червей при правильном выполнении занимают около двух часов. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости начать как минимум с 60 000 червей и поддерживать их во взвешенном состоянии во время распределения. Следуя данной процедуре, можно проводить скрининги с использованием других линий, например, репортерных линий для других индуцибельных путей, с целью разработки модуляторов для этих путей после их изучения.

Этот метод может открыть возможности для исследователей в области высокопроизводительного скрининга и биосенсорики по быстрому выявлению низкомолекулярных модуляторов сигнальных путей или обнаружению загрязняющих веществ в окружающей среде. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять посев, распределение и измерение флуоресцентных штаммов *E. coli* для высокопроизводительного скрининга индуцибельных транскрипционных путей или тестирования множества образцов на наличие загрязняющих веществ в окружающей среде.