Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

В данном видео демонстрируется способ выделения ДНК из образцов тканей, фиксированных в парафине. В качестве примера используется тканевой керн диаметром 3 мм и длиной 6 мм. Несмотря на то, что в данной демонстрации используется один керн, в одной реакции можно обработать более крупные образцы (диаметром более 5 мм и длиной более 10 мм) или два-три керна указанного размера.

Однако следует отметить, что для обеспечения полного удаления парафина и переваривания ткани может потребоваться корректировка протокола. Прежде чем приступать к любым манипуляциям с тканью, необходимо растворить восковой парафин, в котором она законсервирована. Это достигается с помощью ксилола, так как ксилол и фенол токсичны. Любая работа с этими химикатами должна проводиться в вытяжном шкафу; добавьте 800 µL ксилола в пробирку с вашим образцом.

Затем поместите образец на шейкер на 10 минут для осторожного перемешивания. Центрифугируйте образец при 14 000 RPM в течение трех минут для осаждения материала, после чего удалите ксилол и растворенный парафин из пробирки. Повторите эти действия два или три раза до полного растворения парафина.

Ткань должна выглядеть влажной и мягкой. Важно полностью удалить парафин, чтобы увеличить конечный выход ДНК. Поэтому для более крупных образцов ткани требуется большее количество промывок.

Теперь, когда парафин был удален из образца, ткань необходимо регидратировать для обеспечения ее последующего переваривания. Это осуществляется с помощью серии регидратации этанолом. Сначала добавьте 800 µL 100% этанола в образец, перемешайте на вортексе и центрифугируйте образец при 14 000 RPM в течение трех минут.

Удалите супернатант. Повторите эти шаги, используя 800 µL 70% ethanol, а затем 50% ethanol. Последнее центрифугирование должно длиться пять минут, так как ткань станет менее плотной и для осаждения потребуется большая сила.

Теперь ткань необходимо подвергнуть дигестии, чтобы высвободить ДНК из клеток. Это выполняется с использованием лизирующего буфера — раствора, содержащего денатураторы белков, такие как SDS, и протеиназу K — фермент, отвечающий за деградацию тканей.

Добавьте от 200 до 500 µL лизирующего буфера в образец. В зависимости от размера образца оптимальным будет объем 400 µL. Разумеется, состав лизирующего буфера, а также температура инкубации 56 °C подобраны для максимальной активности белка.

Поскольку ACE K является белком, он может разрушать ткани лишь определенное время, поэтому для продолжения реакции необходимо периодически добавлять больше фермента. По 20 µL белка ACE K в концентрации 10 mg/mL добавляют в образец утром и вечером до полного растворения ткани.

Когда твердая ткань более не наблюдается, необходимо экстрагировать ДНК из буфера с клеточным дебрисом. Для разделения образца на водную и органическую фазы используется насыщенный фенол. ДНК содержится в водной фазе.

Важно использовать фенол, насыщенный буфером, так как кислотность обычного фенола не только приводит к деградации вашей ДНК, но и инвертирует расположение водной и органической фаз. Учитывайте, что фенол, насыщенный буфером, хранится в виде двух фаз, при этом фенол представляет собой нижний слой.

Добавьте к образцу равный объем фенола, насыщенного буфером, и несколько раз переверните пробирку. Затем поместите образец в центрифугу и центрифугируйте при 14,000 RPM в течение пяти минут для разделения фаз.

ДНК и РНК будут находиться в верхнем водном слое, тогда как белки, липиды и полисахариды окажутся в интерфазе и нижнем органическом слое. Осторожно снимите водный слой, не затрагивая интерфазу, и перенесите его в новую пробирку. Часто после первого центрифугирования интерфаза оказывается рыхлой и смещенной.

Требуется провести экстракцию с использованием небольших объемов воды. Протокол обратной экстракции приведен в тексте, сопровождающем данное видео. Повторяйте эти действия до тех пор, пока граница раздела фаз не станет прозрачной, что обычно достигается после трех-пяти повторений; далее добавьте к образцу ДНК равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт.

Эта процедура служит той же цели, что и обработка только фенолом, но позволяет сделать межфазную границу более четкой для максимизации выхода ДНК. Повторите данную процедуру один или два раза, пока граница раздела фаз не станет прозрачной и четкой. Теперь, когда образец очищен от белков, необходимо удалить любые contaminating RNA.

Это достигается с помощью РНКаз. РНКаза A добавляется в образец до конечной концентрации 100 мкг/мл, после чего образец инкубируют в течение одного часа при 37 °C. После деградации РНК необходимо удалить фермент РНКаза A.

Процедуру очистки ДНК повторяют, как описано ранее. При использовании сначала фенола, насыщенного буфером, а затем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт потребуется меньше этапов очистки, так как единственным загрязнением теперь являются фермент РНКаза и деградированная РНК. Поскольку теперь образец содержит только ДНК, ее необходимо осадить из раствора, добавив 1/10 объема ацетата натрия и один объем изопропанола.

В качестве альтернативы можно добавить два с половиной объема этанола, но в этом случае потребуется пробирка большего размера. Инкубируйте образец при температуре -20 °C от 30 минут до одного часа или в течение ночи, если вы работаете поздно. Поскольку теперь вы работаете с ДНК, следите за тем, чтобы образец оставался на льду во избежание его деградации.

Центрифугируйте образец при 14 000 RPM в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия, чтобы осадить преципитированную ДНК. Аккуратно удалите супернатант, стараясь не задеть осадок, для удаления избытка солей, которые могут помешать последующим экспериментам, таким как секвенирование. Например, добавьте 1 мл охлажденного 70% этанола и осторожно ресуспендируйте образец.

Снова центрифугируйте образец при 14 000 RPM в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius. Осторожно удалите супернатант и дайте остаткам этанола высохнуть на воздухе в течение не более пяти минут. Важно не пересушить образец.

Наконец, ДНК очищают, после чего она готова к ресуспендированию в выбранном вами буфере. В данном случае мы используем автоклавированную дистиллированную воду. Вот так.

Храните образцы ДНК при температуре -20 °C для последующего использования. После завершения экстракции необходимо оценить качество и количество полученной ДНК. Это выполняется с помощью спектрометрии: используя NanoDrop 2000, установите тип измерения «nucleic acid» (нуклеиновые кислоты), выберите «DNA 50» в качестве метода расчета и инициализируйте прибор, используя 1.5 µL воды.

Очистите пьедестал и проведите измерение холостой пробы, используя 1.5 µL разбавителя. В данном случае — дистиллированной воды. Очистите пьедестал, нанесите 1.5 µL образца и нажмите кнопку измерения. Да. Отлично.

На данном этапе идеальным является соотношение A260/A280, равное 1,8. Ваша ДНК готова к использованию в последующих приложениях, которые включают, помимо прочего, микрочиповый анализ, сравнительную геномную гибридизацию, иммунопреципитацию метилированной ДНК и секвенирование.

Ссылки на эти протоколы приведены здесь на случай, если они не понадобятся немедленно. Храните ваши образцы при температуре -20 °C для последующего использования.