Trichuris Muris Инфекция: Модель Тип 2 иммунитет и воспаление в кишечнике

Общая цель данной процедуры заключается в создании и поддержании естественной модели инфекции H. curcurus. Сначала мышам вводят яйца T. curcurus путем перорального зондирования. Через 21 день инфицированных животных усыпляют, после чего проводят забор крови, брыжеечных лимфатических узлов, фекальных пеллет, ободочной кишки и селезенки.

С помощью этих образцов можно проанализировать иммунный ответ, выработанный против трикков. Мирроры подлежат анализу. Образцы сыворотки можно проанализировать методом ИФА для обнаружения антител, специфичных к TRA.

Для анализа клеточного иммунного ответа можно провести рестимуляцию клеток лимфатических узлов in vitro. Фекальные гранулы можно использовать для определения содержания белка с помощью вестерн-блоттинга, а анализ экспрессии генов можно выполнить с помощью QPCR анализа тканей толстой кишки. Наконец, кончик слепой кишки можно использовать для гистологического исследования, в то время как остальную часть слепой кишки можно использовать для определения гельминтной нагрузки у инфицированных мышей.

В конечном итоге можно получить результаты, позволяющие определить, является ли мышь резистентной или восприимчивой к инфекции trais MOUs, а также охарактеризовать иммунный ответ, развивающийся против паразита. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как определение факторов, контролирующих активацию T-хелперов, а также белков, необходимых для дифференцировки TH2-клеток. Яйца Trauss MOUs могут быть размножены у иммунодефицитных мышей или генетически восприимчивых линий, таких как a KR; сбор яиц проводят через 35 дней после инфицирования у эвтаназированных мышей.

Обнажите вентральную поверхность животного и промойте живот мыши этанолом, используя стерильный пинцет и ножницы. Захватите кожу брюшной стенки и сделайте небольшой разрез. Обнажите содержимое брюшной полости, идентифицируйте слепую кишку и проксимальную часть ободочной кишки, после чего извлеките их.

Перенесите органы в чашку Петри диаметром 10 сантиметров с DMEM, дополненным пенициллином и стрептомицином. Затем с помощью пинцета разрежьте слепую кишку и проксимальную часть ободочной кишки, чтобы открыть просвет и обнажить гельминтов. Поместите вскрытые органы в стакан с PBS и осторожно встряхните, чтобы смыть содержимое кишечника.

После промывки слепой кишки перенесите ее в чистую чашку Петри и с помощью гладких изогнутых пинцетов аккуратно извлеките гельминтов. Перенесите всех гельминтов от каждой мыши в одну лунку шестилуночного планшета, содержащего 5 mL DMEM с добавлением антибиотиков. Поместите шестилуночный планшет вместе с влажным бумажным полотенцем в контейнер Tupperware и инкубируйте при 37 °C в течение четырех часов, чтобы дать гельминтам отложить яйца.

После этой инкубации с помощью пинцета извлеките червей из исходной лунки и распределите их по двум новым лункам с DMEM. Такое разделение червей позволит максимально увеличить выход яиц при использовании пипетки. Соберите оставшуюся среду, содержащую секретируемый антиген и яйца, из исходной лунки и перенесите ее в пробирку Falcon объемом 15 мл.

Центрифугируйте пробирку при 3000 RPM в течение пяти минут. Затем снимите и сохраните супернатант, содержащий антиген четырехчасовой выдержки, а осадок в пробирке промойте стерильной водой. Снова поместите 6-луночный планшет с червями при 37 °C и инкубируйте его в течение ночи до следующего утра.

После удаления червей соберите содержимое лунок, как показано ранее, и центрифугируйте супернатант для выделения яиц. Сохраните супернатант, содержащий антиген после ночной инкубации, а яйца ресуспендируйте в воде. Как и прежде, объедините эти яйца с яйцами, полученными после четырехчасовой инкубации.

Профильтруйте яйца через сито с размером ячеек 70 micron, чтобы удалить остатки червей. Затем перенесите их в квадратную колбу объемом 75 centimeter. Оберните колбу алюминиевой фольгой для защиты от света и храните яйца в течение шести недель при комнатной температуре.

Это позволит икре созреть и пройти стадию эмбриогенеза через шесть недель. Промойте икру, слейте воду и подсчитайте количество жизнеспособных икринок. Показано здесь.

В качестве примера жизнеспособного и нежизнеспособного эмбрионированного яйца Риза доводит концентрацию Эксетера до 50 на 50 µL. На данном этапе яйца могут храниться при температуре 4 °C перед заражением мышей. Обязательно тщательно ресуспендируйте раствор, содержащий яйца.

Перенесите необходимое количество инокулята в пробирку с защелкивающейся крышкой объемом 14 миллилитров и переверните ее для перемешивания. Наберите 200 микролитров яиц в иглу для кормления подходящего размера (в соответствии с размером животного), установленную на шприц объемом один миллилитр. Зафиксируйте мышь за загривком и введите яйца путем перорального зондирования.

Верните инфицированную мышь в клетку и оставьте инфекцию развиваться в течение 21 дня. Через 21 день с помощью негепаринизированного шприца возьмите кровь инфицированных мышей путем пункции сердца. После эвтаназии углекислым газом образцы крови можно хранить при температуре четырех градусов Цельсия.

Для выделения сыворотки и анализа специфических IgGs и IgE с помощью ELISA. Обнажите брюшную полость мыши, как описано ранее. Затем с помощью пинцета извлеките слепую кишку, используя ножницы или второй пинцет.

Отодвиньте тонкий кишечник вправо, чтобы открыть доступ к брыжеечным лимфатическим узлам. Осторожно извлеките лимфатические узлы, стараясь не повредить кишечник, и поместите их в пробирку Falcon объемом 15 мл, содержащую 2 мл среды. В дальнейшем клетки лимфатических узлов можно культивировать in vitro с супернатантом антигена S из культур гельминтов (инкубация в течение 4 часов) для анализа клеточного иммунного ответа на паразита.

После забора лимфатических узлов иссеките слепую и ободочную кишки, как было описано ранее; с помощью пинцета удалите фекальные пеллеты из дистального отдела ободочной кишки, поместив их в пробирку для кислорода объемом two milliliter. Пеллеты можно хранить при температуре minus 20 degrees Celsius и впоследствии проанализировать на содержание белка методом вестерн-блоттинга. С помощью ножниц отрежьте примерно one centimeter проксимального отдела ободочной кишки и поместите в пробирку с RNA. В дальнейшем храните при температуре four degrees Celsius.

Зажмите кончик слепой кишки пинцетом и отсеките примерно пять миллиметров ткани. С помощью трехмиллилитрового шприца и иглы 22 gauge промойте образец раствором PBS. Затем перенесите его в пятимиллилитровый флакон с защелкивающейся крышкой, содержащий 4% паральдегид.

Фиксированный паральдегидом образец слепой кишки можно хранить при температуре 4 °C и использовать для гистологического анализа. Поместите оставшуюся часть слепой кишки в чашку Петри и заморозьте при температуре -20 °C для уничтожения гельминтов. Для облегчения подсчета червей разморозьте слепую кишку, разрежьте ее ножницами и поместите в чашку Петри, содержащую около 5 mL воды.

Разотрите слепую кишку, чтобы открыть просвет, и встряхните ее, собирая фекалии в чашку. Поместите очищенную слепую кишку в новую чашку Петри с водой и с помощью гладких изогнутых пинцетов соскребите эпителиальные клетки кишечника. Перенесите слепую кишку в новую чашку Петри с водой и разорвите ткань на мелкие фрагменты.

Осмотрите фекалии, эпителиальные клетки кишечника и ткани слепой кишки под стереомикроскопом и подсчитайте количество червей, извлекая их по мере подсчета и помещая в чистую чашку. Вот так должны выглядеть черви в слепой кишке до и после изоляции, как показано здесь. После заражения мыши линии black six способны контролировать паразитов, в то время как у мышей KR наблюдается повышенная паразитарная нагрузка.

Аналогично, у восприимчивых мышей линии AKR, согласно результатам сывороточного ELISA, определяются заметно более высокие титры TRA-специфических IgG2a, чем у мышей линии C57BL/6. В этом эксперименте анализ методом вестерн-блоттинга показал, что после инфицирования количество специфического для бокаловидных клеток белка Relmβ увеличилось в фекалиях мышей C57BL/6, но не у мышей AKR. Гистологический анализ дистального отдела слепой кишки демонстрирует гиперплазию бокаловидных клеток и продукцию слизи у резистентных к TRA мышей C57BL/6, но не у восприимчивых мышей AKR.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как размножать яйца trismus, заражать экспериментальных мышей и забирать образцы тканей кишечника, брыжейки, энтеральных лимфатических узлов и крови для анализа инфекции у восприимчивых или резистентных мышей.