Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Надежный подход для контроля доставки органелл на кислых просвет дрожжей вакуоль для деградации и утилизации описано. Метод основан на конкретных маркировки целевой органелл с генетически закодированы двойного излучения флуоресценции рН-биосенсоров и визуализации отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы проследить за поглощением митохондрий в вае в качестве средства изучения аутофагии митохондрий, процесса, известного как митофагия. Это достигается за счет экспрессии в дрожжевых клетках генетически кодируемого и митохондриального митохондриального двухэмиссионного флуоресценции, биосенсора pH под названием Mt Rosea, который маркирует митохондрии красной и зеленой флуоресценцией. В качестве второго шага дрожжевые клетки подвергаются азотному голоданию, чтобы вызвать аутофагию.

Затем мы рассматриваем клетки с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, чтобы визуализировать поглощение митохондрий в ва. Получены результаты, которые показывают накопление красной, но не зеленой флуоресценции в ВА клеток, испытывающих недостаток азота. Показательная оценка аутофагии клеток в популяции позволяет определить степень митофагии.

Использование розовой розы для мониторинга поглощения митохондрий вакуолью дрожжевых клеток может обеспечить механистическое понимание процесса mii. Подход может быть адаптирован для мониторинга аутофагии других клеточных компартментов, таких как ядро, демонстрируя, что процедурой будет Далибор Алика, постдокторант из нашей лаборатории. В этом протоколе мы используем штамм дикого типа BY 4 7 41 и делеционный мутантный штамм дельта А TG 3, полученный из того же генетического фона для визуализации локализации митохондрий.

У этих сортов они помечены флуоресцентным репортером. Rosea Rosea представляет собой двухцветный эмиссионный биосенсор, состоящий из относительно стабильного красного флуоресцентного белка и чувствительного к pH зеленого флуоресцентного белка. Митохондриальная последовательность-мишень используется для нацеливания биосенсора Rosea на митохондриальный матрикс.

Этот репортер был назван горой Розовая: при высоком pH биосенсор флуоресцирует как красным, так и зеленым цветом. Однако при низком pH он флуоресцирует только красным цветом. Штамм дикого типа является контрольным для указания уровней аутофагии, обычно ожидаемых как отрицательный контроль.

Подходит штамм, нулевой для экспрессии основного гена аутофагии. Поскольку такой штамм не может доставить митохондрии в вакуоль, для трансформации штаммов дрожжей с плазмидой, несущей митохондриальный целевой репортер розалы, используются стандартные процедуры для инкубации пластин роста в течение двух-четырех дней при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия до появления колоний диаметром около двух-трех миллиметров для выращивания клеток для индукции аутофагии. Прививайте для каждого штамма одну колонию дрожжей на 10 миллилитров роста. Среда, содержащая неферментируемый источник углерода.

В этом случае этанол и соответствующие бычьи атрофические добавки. Для каждого штамма выращиваются дубликаты культур, в результате чего получается в общей сложности четыре культуры. Инкубируйте дрожжевые культуры в течение примерно 48 часов при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия с орбитальным встряхиванием, к этому времени культуры должны находиться в средней логарифмической фазе роста.

В конце инкубационного периода переложите по два образца по одному миллилитру каждой культуры в 1,7 миллилитров. Пластиковые центрифужные пробирки с защелкивающейся крышкой мягко гранулируют клетки путем центрифугирования на низкой скорости. После центрифугирования осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость из каждой пробирки, не потревожив клеточную гранулу.

Промойте клетки одним миллилитром стерильной дистиллированной воды методом ресуспензии с последующим центрифугированием. Повторите стирку еще два раза, чтобы удалить остатки среды. После третьего промывания ресуспендируйте клетки либо в 100 микролитрах роста, либо в среде азотного голодания.

Среда азотного голодания содержит источник углерода этанол, но не содержит азотных добавок и вызывает аутофагию в клетках. Затем повторно инокулируйте ресуспензионные клетки в 10 миллилитров свежего роста. Среду или 10 миллилитров азотного голодания. Терпимая.

Инкубируйте культуры с встряхиванием орбиты в течение 6-12 часов после индукции аутофагии. Полезно подтвердить доставку Mt Rosea в сосуды под флуоресцентным микроскопом. Вае можно локализовать путем маркировки с помощью синего флуоресцентного красителя на основе кумерина, такого как семь аминокислот четыре хлорметилкумерина, сокращенно L arginine mi cmac arg.

Мечение cmac ARG не нужно выполнять в плановом порядке, но рекомендуется тем, кто не знаком с расположением и внешним видом вакуоли в дрожжах. Для начала процедуры маркировки вакуоли переложите по одному миллилитру образцов каждой культуры в отдельные пластиковые пробирки центрифуги объемом 1,7 миллилитра с защелкивающейся крышкой. Затем добавьте cmac arg в каждую трубку.

Инкубируйте пробирки при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия с встряхиванием орбиты в течение 30 минут. Через 30 минут гранулировать клетки методом центрифугирования, сбросить надосадочную жидкость, промыть клетки одним миллилитром стерильной дистиллированной воды методом суспензии с последующим центрифугированием. Промойте клетки еще два раза стерильной дистиллированной водой.

На этом этапе удаляются остатки среды и избыток кристалла cmac arg. После третьего промывания ревностно суспензируйте клетки в 100 микролитрах стерильной дистиллированной воды. Теперь клетки готовы к установке для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.

При выполнении этого протокола очень важно использовать свежетрансформированные дрожжевые культуры, чтобы обеспечить получение Т-клеток с высокофлуоресцентными митохондриями. Чтобы подготовить живые дрожжевые клетки к визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии, сначала расплавьте два миллиграмма аэроса с низкой температурой плавления в отдельных аликвотах на один миллилитр питательной среды и азотной среды путем инкубации при 70 градусах Цельсия в течение одного часа, расплавленный арос поддерживается при 70 градусах Цельсия. Чтобы установить клетки, нанесите 20 микролитров расплавленного ароса на стеклянный микроскоп размером 76 на 26 миллиметров.

Немедленно нанесите 10 микролитров вымытой клеточной суспензии на ложе. Накройте кровать аросом стеклянной крышкой размером 22 на 22 миллиметра. Ячейки будут распространяться по поверхности агроса под покровным покровом.

Затем тщательно заклейте края чехла листом тонкой пленкой лака для ногтей. Это предотвратит обезвоживание и смещение покровного стекла Во время визуализации, когда лак для ногтей полностью высох, предметные стекла готовы к просмотру с помощью установленных флуоресцентных микроскопических клеток. Использование этой методики может наблюдаться в течение одного часа после монтажа без каких-либо видимых побочных эффектов на клетки.

Поскольку дрожжевые клетки относительно невелики, вам понадобится флуоресцентный микроскоп хорошего качества, оснащенный фильтрами возбуждения, подходящими для раздельной визуализации излучения GFP и излучения RFP, и объектив с 60-кратным погружением в воду с числовой апертурой 1,2. Типичные результаты получены с помощью МТ Розовая, выраженная в клетках дикого типа и с помощью конфокального лазерного сканирования. Здесь показана микроскопия в условиях отсутствия голода с этанолом в качестве источника углерода, в то время как типовые клетки демонстрируют типичное клеточное распределение митохондрий на периферии дрожжевых клеток, которые демонстрируют как красную, так и зеленую флуоресценцию.

Красное и зеленое флуоресцентное излучение в вакуоль не обнаруживается. Когда MT. Клетки, экспрессирующие розею, дикого типа подвергаются азотному голоданию в течение шести часов и более. Они проявляют в дополнение к красной и зеленой флуоресценции, соответствующей митохондриям, накопление красной, но не зеленой флуоресценции в ва.

Этот сигнал является признаком аутофагии. Аутофагическое поглощение митохондрий уларом. Локализация розеи может быть отдельно подтверждена с помощью CMAC arg.

В противоположность этому, митофагия отрицательная контролирует клетки, экспрессирующие МТ. Розовая вина, наблюдаемая до голодания и после шести часов и после голодания, не показывает накопления красной флуоресценции в вакуоль. В то время как митохондриальная маркировка остается сильной для оценки уровня аутофагии у дикого типа и мутантных штаммов A TG three, более 200 клеток на штамм наблюдались для накопления красной флуоресценции в оле до индукции аутофагии и в выбранные временные моменты. но не в дельта АТГ три мутантные клетки, которые не могут доставить митохондрии в вакуоль после ее развития. Этот метод открывает путь для исследователей в области аутофагии к изучению доставки митохондрий и других органелл, таких как ядро, в VA, а также различные условия роста в этих клетках.