Мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизация анализ (mPCR / RLB)

Общая цель этой процедуры заключается в определении наличия или отсутствия панели специфических последовательностей нуклеиновых кислот, ранее амплифицированных в реакции мультиплексной ПЦР. Это достигается путем фиксации меченых амином зондов ДНК на многоразовой нейлоновой мембране. Затем меченные биотином ПЦР-продукты гибридизуются с мембраносвязанными зондами и стрептококковым TTR в пероксидазе.

Конъюгат добавляют в связанные продукты ПЦР. Затем связанные продукты ПЦР детектируются путем добавления реагентов для детектирования хемилюминесценции и воздействия на мембрану высокочувствительной рентгеновской пленки. Наконец, мембрана промывается для удаления гибридизованных продуктов ПЦР, что позволяет повторно использовать ее для будущих анализов.

В конечном итоге могут быть получены результаты, которые показывают гибридизацию продуктов ПЦР с мембранно-связанными зондами на рентгеновской пленке. Основные преимущества этой методики перед существующими методами, такими как мультиплексная ПЦР, с гель-электрофорезом в реальном времени ПЦР или микрочипом, заключается в том, что она обладает высокой пропускной способностью, относительно быстра, не требует какого-либо специализированного оборудования, а главное недорога. Прежде чем начать, приготовьте следующие растворы в соответствии с письменной частью этого протокола.

Чтобы подготовить мембрану, разогрейте духовку до 60 градусов Цельсия. Очистите мини-промокашку с 70% этанолом, разведите олигонуклеотидные зонды в 0,5 молярного бикарбоната натрия до конечной концентрации двух пикомолев на микролитр и объема 200 микролитров. Обрежьте нейлоновую мембрану размером 15 на 15 сантиметров с помощью карандаша и линейки, отметьте 0,5 сантиметра поперек верхней части мембраны, и напишите там детали эксперимента.

Запечатайте мембрану в полиэтиленовый пакет с 20 миллилитрами свежеприготовленного 16% раствора EDAC и покачивайте ее при комнатной температуре в течение 10 минут. Промойте мембрану в деионизированной воде в течение 30 секунд. Далее поместите мембрану в мини-промокашку с каналами, проходящими через мембрану.

Затем положите поддерживающую подушку на место и закройте промокательную промокашку. Тщательно отсасывайте любую жидкость из каналов. Заполните дорожки 1 и 45 150 микролитрами 0,5 молярного бикарбоната натрия.

Используйте по 150 микролитров каждого раствора щупа для заполнения полос от 2 до 44 последовательно, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Если пузырь воздуха все же появился в канале, удерживая пипетку на месте, быстро откачайте раствор, чтобы пузырь воздуха всплыл к верхней части наконечника пипетки, а затем повторите попытку. Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут.

Отсасывайте растворы зонда. Снимите мембрану и промойте ее в 250 миллилитрах 0,1 моляра гидроксида натрия при комнатной температуре в течение девяти минут. Промойте мембрану в 250 миллилитрах два раза SSPE в течение 30 секунд.

Затем постирайте его в 250 миллилитрах предварительно разогрейте два раза SSPE 0,1% SDS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение пяти минут, если не сразу используете для гибридизации. Промойте мембрану в 240 миллилитрах 20 миллимоляров ЭДТА при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем продают мембрану в полиэтиленовом пакете с оставшимися 10 миллилитрами 20 миллимолярной ЭДТА и хранят при температуре четыре градуса Цельсия.

Наконец, вымойте мини-блоссер с моющим средством pyro neck, ополосните щеткой и дайте ему высохнуть. ПЦР-амплификация интересующих нас мишеней не описана в данной демонстрации, но должна быть выполнена до профессиональной гибридизации. Перед началом процедуры гибридизации приготовьте следующие растворы согласно письменной части настоящего протокола.

Включите одну духовку и установите на 60 градусов Цельсия, а другую духовку на 42 градуса Цельсия. Доведите воду до кипения в большом стакане на горячей плите. Очистите мини-промокашку 70% этанолом.

Далее аликвоту 10 миллилитров в два раза ПСПЭ 0,1% SDS в небольшую емкость. Затем добавьте по 20 микролитров каждого продукта ПЦР в 150 микролитров двукратного SSPE 0,1% SDS в пронумерованные пробирки. Прокипятите продукты ПЦР в течение 10 минут при температуре 100 градусов Цельсия с помощью держателей из пенополистирола, поместите их на лед немедленно минимум на пять минут.

Промойте мембрану в оставшихся 240 миллилитрах два раза SSPE 0,1% SDS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение пяти минут. Поместите мембрану в мини-промокашку с подкладочной подушкой. Ориентируйте его так, чтобы каналы шли вертикально.

Отсосите лишнюю жидкость из каналов мини-промокашки. Добавьте оставшиеся 150 микролитров в два раза больше SSPE 0,1% SDS в первый и последний каналы. Добавьте прокипяченные продукты ПЦР в каналы от второго до 44 последовательно, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха.

Поместите мини-блоттер в духовку при температуре 60 градусов Цельсия на один час, чтобы произошла гибридизация. Распылите жидкость из каждого канала. Затем снимите мембрану с мини-промокашки.

Промываем дважды в заранее предупрежденных 250 миллилитров двухкратного SSPE, 0,5% SDS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут. Смочите нейлоновую подложку двукратным SSPE 0,5% SDS при 42 градусах Цельсия и используйте его для сворачивания мембраны. Поместите свернутую мембрану в роликовую трубу и отсоедините, чтобы мембрана прилегала к внутренней поверхности.

Добавьте три микролитра стрептококтального AD в пероксидазный конъюгат до 15 миллилитров двукратного SSPE, 0,5% SDS при 42 градусах Цельсия и добавьте в тюбик. Плотно закрутите крышку и выдерживайте в роликовой духовке при температуре 42 градуса Цельсия в течение 60 минут. Следите за тем, чтобы направление рулона было таким, чтобы мембрана не затягивалась.

Периодически проверяйте наличие утечек. Промойте мини-промокашку в моющем средстве pyro neck и воде, промойте и дайте ей высохнуть. Снимите мембрану с роликовой трубки, промойте два оставшихся раза SSPE 0,5% SDS при 42 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем дважды постирайте в два раза SSPE при комнатной температуре в течение пяти минут. Включите обе духовки до 80 градусов Цельсия и поместите 500 миллилитров 1% SDS в одну духовку для предварительного разогрева. Приготовьте раствор ECL и инкубируйте мембрану в растворе для обнаружения ECL в течение двух минут.

Затем подвергните мембрану пленке и проявите. Повторите воздействие с более длительным или более коротким временем, если это необходимо для регенерации мембраны. Постирайте его в 250 миллилитрах 1%SDS при 80 градусах Цельсия в течение 30 минут дважды.

Затем Вашингтон 240 миллилитров 20 миллимолярной ЭДТА при комнатной температуре в течение 15 минут. Запечатайте мембрану в полиэтиленовый пакет с 10 миллилитрами 20 миллимолярной ЭДТА и холодильником при температуре четыре градуса Цельсия для повторного использования в будущем. На этом рисунке представлены результаты мультиплексного анализа гибридизации методом обратной линии ПЦР: образцы с первого по шестой представляют положительный контроль между ними.

Для каждого из 43 пробников имеется по крайней мере один положительный сигнал пробника. Каждая целевая последовательность от A до U обнаруживается с помощью двух разных зондов для максимизации специфичности зондов. Единица и двойка представляют видоспецифичные зонды, которые, как ожидается, будут положительными для каждого образца и помогут ориентировать пленочный зонд.

Единица повторяется в нижней части мембраны. Седьмой и восьмой образцы являются отрицательным контролем. Следует отметить, что зонды Q1, Q2, T 1 и T 2 имеют сигнал в отрицательных контролях, указывающий на вероятное неспецифическое связывание праймеров или димера праймера.

Потребуется перепроектирование этих зондов или праймеров, зондов C-1, D-1 и F1 с полосами на мембране, вероятно, из-за некоторого неспецифического поглощения стрептококкового TD в пероксидазе, конъюгате или хемилюминесцентном субстрате. Тем не менее, это легко отличить от истинно положительных проб. Сигнальные зонды D 1 и D 2 имеют относительно слабые сигналы по сравнению с другими зондами.

Это может быть связано с более крупными ампликонами, что приводит к менее эффективному усилению. Наконец, зонд J 2 отрицательный в нескольких образцах, где зонд J 1 положительный. Скорее всего, это представляет собой мутацию в сайте связывания J two для этих образцов.

После освоения этой техники от экстракции ДНК с помощью гибридизации PCR Pro, интерпретация результатов и регенерация мембраны могут быть выполнены менее чем за 10 часов.