ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мэттью О `Салливан и Фэй Чжоу являются получателями Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета последипломного Стипендии медицинских исследований.

<ol><li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li>
<li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li>
<li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li>
<li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li>
<li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%2C+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li>
<li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li>
<li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li>
<li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li>
<li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+%28mPCR%2FRLB%29+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+%28mPCR%2FRLB%29+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

MPCR / RLB метод позволяет одновременное обнаружение большого количества ампликонов ПЦР. Из-за высокой чувствительности хемилюминесцентный зонд основе обнаружения, одной мультиплексной ПЦР реакция с большим количеством пар праймеров могут быть использованы для усиления ДНК. Если ни один датчик сигналов, полученных с одного или нескольких образцов, проведение гель-электрофореза с любой оставшийся продукт ПЦР может помочь отличить, является ли проблема с ПЦР-амплификации или зонда гибридизации. Там, где все сигналы датчика на мембране являются слабыми или отсутствуют, но гель-электрофореза указывает на успешное ПЦР-амплификации, возможности включают проблемы с маркировки мембрану, неправильной регенерации мембран после предыдущего использования, неправильной температуре во время инкубации гибридизации или стрептавидин, или дефектные стрептавидином сопряженных пероксидазы или обнаружения реагента. Если контрольные пробы показывают, что отдельные зонды может производить ложные отрицательные сигналы, один ПЦР с гелем основе выявления и последующего секвенирования могут быть выполнены, чтобы проверить усиления ПЦР-продукт и искать последовательность изменения в сайт связывания зонда. Слабый или отсутствующий датчик сигнала может быть связано с большим размером ампликона: если возможно все ампликонов должна быть такой же длины и менее 300 бп. Вторичные структуры ДНК ампликонов также может привести к плохой обязательным зонд и может привести к ре-дизайн праймеров. Индивидуальные грунтовки или зонд концентрации могут также быть изменены для оптимизации сигнала. Ложные положительные сигналы из-за связывания зонда nonamplified грунтовок или праймер-димеров продукт может быть исследована путем проведения ПЦР с одного на основе геля обнаружения и последующего секвенирования. Если это произойдет, редизайн зондов, которые могут потребоваться. Точечные мутации в сайтах связывания зонда может привести к слабой или отсутствия сигналов. Разрешение двух зондов для каждого продукта усиливается делает это легко обнаружить. Эта особенность может быть использована с тщательной грунтовки и зонда дизайн для обнаружения малых изменений последовательности ДНК-мишени. Таким образом, в то время как Есть много методов обнаружения следующих продуктов мультиплекс ПЦР доступны, mPCR / RLB имеет преимущество в том, высокую пропускную способность и недорогую установку с низким затрат. Гибкость метода позволяет использовать его в для широкого спектра применений.

<table border="1"><tbody><tr><th> Реагент </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> 5 &#39;амин C6 изменение олигонуклеотидных зондов </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 М раствор доводят до рН 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 М раствор </td></tr><tr><td> 20xSSPE буфер </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Додецилсульфата натрия (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Составляют 10% маточного раствора, не автоклав, должны храниться в течение 1 недели максимальная перед использованием </td></tr><tr><td> Этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Макияж 0,5 М раствор доводят до рН 8,0 и автоклава </td></tr><tr><td> N-(3-диметиламинопропил)-N &#39;-этилкарбодиимида (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Макияж 20 мл 16% раствора непосредственно перед использованием использованием EDAC 3,2 г и 18 мл воды Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 мкм нейлона Мембрана 20x20 см </td><td> PALL наук о жизни </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Деионизированная, вода очищенная </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Жидкие моющие средства Pyroneg </td><td> Джонсон Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Стрептавидин-пероксидазы сопряженным </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL обнаружения реагентов </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL обнаружения реагентов </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP Прозрачная пленка </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 ОНР </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hyperfilm ECL высокую производительность хемилюминесцентный фильм 18х24 см </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Лед </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Расходные материалы, используемые в mPCR / RLB анализа. <table border="1"><tbody><tr><th> Оборудование </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> Hybaid Печи Shake&#39;n&#39;Stack (2) прокатка бутылку и нейлона разделяющая сетка </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Метод может быть выполнена с одной печью тех пор, пока есть средство для поддержания растворов при 42 ° С и 60 ° С до использования </td></tr><tr><td> Качалка Belly Dancer платформы </td><td> Стовалл науки о жизни </td><td> Евро BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Водяная баня </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Всасывающий </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Электрическая плита </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Выдержки картридж </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Рентгеновской пленки разработчика </td><td></td><td></td><td> Можно также использовать разработчик, фиксажа и воды в лотки в темной комнате, а не автоматизированнаяразработчик. Lumino-тепловизор может также быть использован вместо фильма Xray </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Оборудование, необходимое для mPCR / RLB анализа.

Мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизация анализ (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Мультиплекс ПЦР / Обратная линия блот гибридизация анализа позволяет обнаруживать до 43 молекулярных мишеней в 43 образцах с помощью одной мультиплексной ПЦР реакции следуют зонда гибридизации на нейлоновую мембрану, которая повторного использования. Зонды 5 &#39;амин изменена, чтобы фиксации мембраны. Грунтовки 5 &#39;биотин изменение, которое позволяет обнаружения гибридизированных продуктов ПЦР с использованием стрептавидин-пероксидазы и хемилюминесцентный субстрат с помощью светочувствительной пленке. При низкой установки и затраты на расходные материалы, эта технология является недорогой (около 2 долл. США в выборке), высокая пропускная способность (несколько мембраны могут быть обработаны одновременно) и короткие сроки выполнения работ (около 10 часов). Метод может быть использован в ряде направлений. Несколько зонды могут быть предназначены для обнаружения последовательности изменения в пределах одного усиленный продукт, или несколько продуктов могут быть усилены одновременно, с одним (или более) зонды используются для последующего обнаружения. Сочетание обоих подходов также может быть использован в рамках одного теста. Возможность включать несколько зондов для одной последовательности целевой делает анализ весьма специфичны. Опубликованные приложения mPCR / RLB обнаружения включают антибиотик 1,2 генов устойчивости, введя метициллин-резистентный золотистый стафилококк 3-5 и Salmonella SP 6, молекулярной серотипирование Пневмококк 7,8, Streptococcus agalactiae 9 и энтеровирусы 10,11, идентификация микобактерий SP 12, выявление половых 13-15 и дыхательных путей 16 и 17 другими патогенами и обнаружения и идентификации mollicutes 18. Тем не менее, универсальность средств технического применения практически безграничны и не ограничивается молекулярного анализа микроорганизмов. Пять шагов в mPCR / RLB являются: а) Primer и зонда дизайн, б) выделения ДНК и ПЦР-амплификации с) подготовка мембраны, г) Гибридизация и обнаружения, и д) Регенерация мембраны.

Недорогие, высокая пропускная способность метода для одновременного обнаружения до 43 молекулярных мишеней описано. Применение mPCR / RLB включают набрав микробного и обнаружение нескольких возбудителей из клинических образцов.

Мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизация анализ (mPCR / RLB)

Метод мультиплексной ПЦР с последующей гибридизацией по методу обратного лайн-блота позволяет обнаруживать до 43 молекулярных мишеней в 43 образцах с использованием одной реакции мультиплексной ПЦР ...

Общая цель данной процедуры заключается в определении наличия или отсутствия панели специфических последовательностей нуклеиновых кислот, предварительно амплифицированных в ходе мультиплексной ПЦР. Это достигается путем первоначальной фиксации ДНК-зондов с аминогруппами на многоразовой нейлоновой мембране. Затем продукты ПЦР, меченные биотином, гибридизуются с иммобилизованными на мембране зондами и стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой.К связанным продуктам ПЦР добавляют конъюгат. Затем связанные продукты ПЦР детектируют путем добавления реагентов для хемилюминесцентного детектирования и экспонирования мембраны на высокочувствительную рентгеновскую пленку. В завершение мембрану промывают для удаления гибридизованных продуктов ПЦР, что позволяет использовать ее повторно в последующих анализах.В итоге можно получить результаты, демонстрирующие гибридизацию продуктов ПЦР с иммобилизованными на мембране зондами на рентгеновской пленке. Основными преимуществами данной методики перед существующими методами, такими как мультиплексная ПЦР с гель-электрофорезом, ПЦР в реальном времени или микрочиповый анализ, являются ее высокая пропускная способность, относительная скорость, отсутствие необходимости в специализированном оборудовании и, что самое важное, низкая стоимость. Перед началом работы приготовьте следующие растворы в соответствии с текстовой частью данного протокола.Для подготовки мембраны предварительно разогрейте oven до 60 °C. Очистите мини-блоттер 70% ethanol, разведите олигонуклеотидные зонды в 0.5 M бикарбонате натрия до конечной концентрации 2 pmol/µL и объема 200 µL. Вырежьте нейлоновую мембрану размером 15 × 15 cm; используя карандаш и линейку, отметьте в верхней части мембраны поле шириной 0.5 cm и запишите там данные эксперимента.Поместите мембрану в пластиковый пакет с 20 миллилитрами свежеприготовленного 16% раствора EDAC и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут на качалке. Промойте мембрану деионизированной водой в течение 30 секунд. Затем поместите мембрану в мини-блоттер таким образом, чтобы каналы проходили поперек мембраны.Затем установите опорную подушку и закройте блоттер. Тщательно аспирируйте всю жидкость из каналов. Заполните дорожки 1 и 45 150 µL 0.5 M бикарбоната натрия.Используйте по 150 µL каждого раствора зонда для последовательного заполнения лунок со второй по 44-ю, стараясь избегать появления пузырьков воздуха. Если в канале появился пузырек воздуха, не вынимая пипетку, быстро аспирируйте раствор, чтобы пузырек поднялся к кончику наконечника, затем повторите попытку. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.Отоснимите растворы зондов. Извлеките мембрану и промойте ее в 250 миллилитрах 0,1 молярного гидроксида натрия при комнатной температуре в течение девяти минут. Промойте мембрану в 250 миллилитрах 2× SSPE в течение 30 секунд.Затем промойте её дважды в 250 миллилитрах предварительно нагретого в печи при 60 °C буфера SSPE с 0.1% SDS в течение пяти минут, если мембрана не будет использована для гибридизации немедленно. Промойте мембрану в 240 миллилитрах 20 мМ EDTA при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем поместите мембрану в пластиковый пакет с оставшимися 10 миллилитрами 20 мМ EDTA и храните при 4 °C.Наконец, промойте мини-блоссер с помощью моющего средства для горлышек пробирок и щетки, затем прополощите и оставьте до полного высыхания. ПЦР-амплификация целевых последовательностей в данной демонстрации не описывается, но она должна быть проведена перед гибридизацией зондов. Перед началом процедуры гибридизации приготовьте следующие растворы в соответствии с текстовой частью данного протокола.Включите один термостат (печь), установив температуру 60 °C, а другой — 42 °C. Доведите воду до кипения в большом стакане на плитке. Очистите мини-блоттер 70% этанолом.Затем отберите аликвоту 10 milliliters двухкратного SSPE 0.1%SDS в небольшой контейнер. После этого добавьте по 20 microliters каждого ПЦР-продукта к 150 microliters двухкратного SSPE 0.1%SDS в пронумерованные пробирки. Прокипятите ПЦР-продукты в течение 10 minutes при 100 degrees Celsius, используя пенопластовые держатели, и немедленно поместите на лед минимум на пять minutes.Промойте мембрану в оставшихся 240 миллилитрах двухкратного SSPE с 0.1% SDS в печи при 60 °C в течение пяти минут. Поместите мембрану в мини-блоттер с поддерживающей прокладкой. Расположите ее так, чтобы каналы были ориентированы вертикально.Отососите избыток жидкости из каналов мини-блоттера. Добавьте оставшиеся 150 µL двухкратного SSPE с 0,1% SDS в первый и последний каналы. Последовательно добавьте проваренные продукты ПЦР в каналы со второго по 44-й, стараясь избегать появления пузырьков воздуха.Поместите мини-блоттер горизонтально в печь при температуре 60 °C на один час для проведения гибридизации. Слейте жидкость из каждого канала. Затем извлеките мембрану из мини-блоттера.Дважды промыли в предварительно нагретом до 60 °C объеме 250 мл 2× SSPE с 0,5% SDS в термостате в течение 10 минут. Увлажнили нейлоновую подложку раствором 2× SSPE с 0,5% SDS при 42 °C и с ее помощью свернули мембрану в рулон. Поместили свернутую мембрану в роллер и зафиксировали так, чтобы мембрана плотно прилегала к внутренней поверхности.Добавьте 3 µL конъюгата strept AD с пероксидазой к 15 mL 2-кратного буфера SSPE с 0,5% SDS при 42 °C и перенесите смесь в пробирку. Плотно закрутите крышку и инкубируйте в ротаторе при 42 °C в течение 60 минут. Убедитесь, что направление вращения подобрано так, чтобы мембрана не натягивалась.Периодически проверяйте систему на наличие утечек. Промойте мини-блоттер с использованием моющего средства для горлышек пиролиза и воды, затем дайте ему высохнуть. Извлеките мембрану из валика и промойте ее дважды в оставшихся двух порциях буфера SSPE с 0.5% SDS при 42 °C в течение 10 минут.Затем дважды промойте мембрану в двух объемах буфера SSPE при комнатной температуре в течение пяти минут. Нагрейте обе печи до 80 °C и поместите 500 milliliters 1%SDS в одну из печей для предварительного нагрева. Приготовьте раствор ECL и инкубируйте мембрану в растворе для ECL-детекции в течение двух минут.Затем экспонируйте мембрану на пленку и проявите её. При необходимости повторите экспозицию с более длительным или коротким временем для регенерации мембраны. Дважды промойте её в 250 milliliters 1%SDS при 80 °C в течение 30 минут.Затем промойте мембрану 240 миллилитрами 20 миллимолярного EDTA при комнатной температуре в течение 15 минут. Поместите мембрану в пластиковый пакет с 10 миллилитрами 20 миллимолярного EDTA и храните в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия для последующего использования. На этом рисунке представлены результаты мультиплексного ПЦР-анализа с использованием метода обратного линейного блот-гибридизации. Образцы с первого по шестой представляют собой положительные контроли.Для каждого из 43 зондов наблюдается как минимум один положительный сигнал. Каждая целевая последовательность от A до U детектируется с помощью двух разных зондов для максимального повышения специфичности. Зонды «один» и «два» представляют собой видоспецифичные зонды, которые должны давать положительный результат для каждого образца и помогают при ориентации пленки с зондами.В нижней части мембраны повторяется образец 1. Образцы 7 и 8 являются отрицательными контролями. Обратите внимание, что зонды Q1, Q2, T1 и T2 дают сигнал в отрицательных контролях, что указывает на вероятное неспецифическое связывание праймеров или образование димеров праймеров.Потребуется переработка дизайна данных зондов или праймеров; зонды C1, D1 и F1 демонстрируют шлейфы на мембране, что, вероятно, обусловлено неспецифическим поглощением стрептавидин-пероксидазного конъюгата или хемилюминесцентного субстрата. Однако это легко отличить от истинно положительных сигналов зондов. Сигналы зондов D1 и D2 относительно слабы по сравнению с другими зондами.Это может быть связано с тем, что более крупные ампликоны приводят к менее эффективной амплификации. Наконец, зонд J two дает отрицательный результат в нескольких образцах, где зонд J one дает положительный результат. Вероятнее всего, это указывает на наличие мутации в сайте связывания J two в этих образцах.После освоения данной методики — от экстракции ДНК до гибридизации с PCR Pro — интерпретация результатов и регенерация мембраны могут быть выполнены менее чем за 10 часов.

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Мы описываем мультиплекс метод обнаружения микроорганизмов в образце с использованием олигонуклеотидных связью флуоресцентные бусы. Ампликона из всех организмов, в пределах образца гибридизации с панели зонда связью бисером. Luminex или Bio-Plex инструмент используется для запроса каждая бусинка для бортовых и гибридизации типа сигнала.

Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

В этом видео мы демонстрируем метод дуплексной цифровой ПЦР (ddPCR) — модификацию традиционной методики ПЦР, которая полезна для одновременного обнаружения двух разных генетических маркеров. Одна реакция ПЦР разбивается на эмульгированные капли размером в нанолитр, которые амплифицируются независимо друг от друга, а для вычисления начальной концентрации целевых последовательностей используется обнаружение сигналов усиления флуоресценции разного цвета из фракции капель.

Дуплексная цифровая ПЦР для одновременного количественного определения двойных генетических маркеров

Мы демонстрируем простой мультиплексный ПЦР-анализ для быстрого скрининга и типирования типов I-V стафилококковой кассетной хромосомы mec для метициллин-резистентного золотистого стафилококка, а также предоставляем некоторые важные шаги и процедурные нюансы, которые делают его успешным для адаптации этого анализа к отдельным лабораториям.

??????????? ??? ??? ??????????? ??????????????? ??????? ????????? ??? ????? I ?? V ? ??????????-??????????<em&gt; ?????????? ???????????</em

Линейно-амплификации опосредованной (ЛАМ)-ПЦР является метод, разработанный для определения точных координат интеграции вирусных векторов в геноме. Техника развивались, чтобы быть лучшим методом для изучения клоновых динамику у пациентов генной терапии, биобезопасности новых векторных технологий, Т-клеточного разнообразия, моделей стволовых раковых клеток, и т.д.

Линейного усиления опосредованного ПЦР - Локализация генетических элементов и характеристика Неизвестного фланговые ДНК

Генетический репортерный анализ является хорошо зарекомендовавшим себя и мощным инструментом для анализа взаимосвязи между последовательностями ДНК и их генной регуляторной активностью. Связывание потенциальных регуляторных элементов с репортерными генами, несущими идентификационные метки последовательности, обеспечивает массовое распараллеливание этих анализов.

Массивно-параллельных Репортер Анализы в культивируемых клетках млекопитающих

Provided — это протокол для разработки анализа амплификации рекомбиназной полимеразы в реальном времени для количественного определения начальной концентрации образцов ДНК с использованием либо термоампликатора, либо микроскопа и нагревателя предметного столика. Также описана разработка системы внутреннего положительного контроля. Предоставляются скрипты для обработки необработанных флуоресцентных данных в реальном времени.

Развитие количественной рекомбиназу полимеразной амплификации с внутреннего положительного контроля

Этот протокол описывает изготовление малых, готовых к использованию кассеты, которые могут быть применены для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, тест, который прост в эксплуатации. В этом подходе капиллярные массив был использован для мультиплекс и высокоэффективного обнаружения целей ГИО.

Визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в массиве капилляров

Текущий мультиплексированных диагностики для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге вирусов требуется Комплекс пробоподготовки и дорогой аппаратуры и трудно для использования в условиях ограниченных ресурсов. Мы покажем диагностики, который использует изотермической амплификация с целевыми стренги переносные датчики для обнаружения и дифференцировать эти вирусы с высокой чувствительностью и специфичностью.

Мультиплексированных изотермической амплификация на основе диагностики платформы для обнаружения Зика, чикунгуньи и денге 1

Этот протокол описывает важнейшие шаги и меры предосторожности, необходимые для выполнения одноклеточного мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим. Эта техника является простой и эффективный метод для анализа выражения профиль заранее определенный набор генов из одной клетки характеризуются патч зажим записей.

Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим

В этой работе обобщены шаги по разработке различных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Шаги проработаны, и были включены примечания о том, как улучшить анализы и результаты экспериментов. Эти анализы могут использоваться для нескольких приложений SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

В этом протоколе демонстрируется анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени на основе пан-лиссавируса LN34 от сбора тканей до интерпретации результатов, включая обновление последовательностей праймеров и составов для повышения эффективности анализа некоторых лиссавирусов и зайцеобразных, не вызывающих бешенство. Мы также демонстрируем установку анализа для однолуночного мультиплексированного формата LN34 (LN34M).

Посмертная диагностика бешенства у животных с помощью обновленного мультиплексного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией LN34 в реальном времени

Узнайте метод мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизации для одновременного выявления до 43 молекулярных мишеней у патогенов. Этот недорогой высокопроизводительный протокол подходит для клинических образцов.

Мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизация анализ (mPCR / RLB)

Больше видео