Vibratome на разделы для работы с улучшенными Сохранение Cytoarchitecture из млекопитающих орган Корти

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении изображений кортиева органа с максимальным сохранением клеточной архитектуры. Это достигается путем секционирования препарированных и зафиксированных внутренних ушей с помощью вибратома для получения толстых срезов при минимизации количества поверхностей разреза на одну улитку. Затем срезы, полученные на вибратоме, окрашиваются методом иммуногистохимии, что позволяет идентифицировать различные типы клеток и клеточные структуры в кортиевом органе.

Затем срезы монтируют и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии для получения изображений высокого разрешения, определяющих Z-положения. В результате обработки каждого толстого среза Vibram получаются данные, позволяющие проводить конфокальную микроскопию клеток и структур улитки с минимальными повреждениями, вызванными процессом секционирования. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как парафиновое или криосекционирование, является минимизация физического повреждения улитки, что обеспечивает лучшую сохранность клеточной архитектуры улитки. Для выделения внутреннего уха сначала обезглавьте эвтаназированную взрослую мышь с помощью лезвия бритвы.

Раскройте череп по средней линии, затем осторожно удалите головной мозг с помощью пинцета, чтобы обнажить каждое ухо, и извлеките оба внутренних уха. Поместите внутренние уха в криопробирку со свежим 4% раствором параформальдегида и осторожно перемешивайте в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия. На следующий день удалите фиксатор, трижды промыв ткани одним кратным фосфатно-солевым буфером (PBS), и проведите декальцинацию тканей взрослой особи путем инкубации в 10% растворе EDTA при температуре четырех градусов Цельсия в течение пяти дней.

Промойте внутренние ушные раковины и храните их в 1× PBS до начала обработки. Приготовьте 4%-й раствор низкоплавкого агароза, добавив агарозу в 1× PBS и нагревая в микроволновой печи до полного растворения. Держите расплавленную агарозу на водяной бане при 55 °C до момента использования.

Извлеките внутреннее ухо из PBS с помощью пинцета и поместите его на дно съемной формы для заливки. Пипеткой удалите остатки жидкости, затем полностью заполните форму Mol C. Void, чтобы полностью покрыть внутреннее ухо для последующего изготовления поперечных срезов через кортиев орган. Расположите внутреннее ухо таким образом, чтобы оно было видно сбоку, с видом на латеральный полукружный канал.

Расположите внутреннее ухо под таким углом, чтобы линия, образованная самой задней областью улитки, находилась под углом 45 градусов к предполагаемой плоскости сечения. После затвердевания агарозы снимите пластиковую форму. С помощью лезвия бритвы обрежьте излишки агарозы, чтобы сформировать куб.

Убедитесь, что вокруг оставлено достаточное количество агароза для надежной поддержки ткани. При нарезке прикрепите основание кубика агароза к режущей поверхности вибратома с помощью суперклея; выполняйте срезы толщиной от 40 до 100 мкм и собирайте срезы в чашку с 1× PBS с добавлением 0,1% Triton X 100, используя пинцет.

Аккуратно отделите срезы от подложки. Перенесите срезы в чашку с одним объемом свежего 1× PBS с 0,1% Triton X 100, используя наконечник дозатора с широким отверстием, и приступите к окрашиванию антителами в планшете для культивирования клеток. После завершения окрашивания антителами срезы ткани монтируют на предметное стекло микроскопа.

Чтобы предотвратить раздавливание толстых срезов ткани, нанесите вакуумную смазку квадратом вокруг среза, чтобы создать пространство между покровным стеклом и предметным стеклом. Перенесите срез ткани на предметное стекло. Плотно прижмите края покровного стекла, чтобы обеспечить герметичность.

В качестве альтернативы нанесите по одной микролитровой капле хроматографической смолы ETA с известным размером пор в каждый из четырех углов, где будет располагаться покровное стекло; накройте образец стеклом и загерметизируйте края лаком для ногтей перед началом визуализации. На первом Z-стеке конфикального микроскопа через срез органа Корти видны внутренние волосковые клетки, соседние внутренние волосковые клетки, наружные волосковые клетки и клетки Дейтерса. При ядерном окрашивании опорные клетки становятся видны благодаря окрашиванию антителами к S 100 и выглядят желтыми. По мере продвижения Z-стека через срез с шагом 3 мкм количество опорных клеток можно подсчитать, фиксируя появление и исчезновение их ядер.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять срезы внутреннего уха с помощью вибратома, проводить иммуногистохимический анализ этих срезов и затем выполнять визуализацию с помощью конфокальной микроскопии. Эта простая процедура, применимая к любым антителам, обеспечивает максимальное сохранение клеточной организации кортиева органа.