Быстрое подход к высоким разрешением флуоресценции в Semi-ломтики толщиной мозга

Основная цель данной процедуры — упростить визуализацию флуоресцентных нейронов в толстых срезах мозга. Для этого сначала мозг помещают в держатель для пробок aeros. На втором этапе процедуры мозг нарезают на толстые срезы с помощью компрессионного томографа.

Третьим этапом процедуры является оптическое просветление срезов мозга в градиенте глицерина. Заключительным этапом процедуры является закрепление просветленных срезов мозга на предметных стеклах для флуоресцентной визуализации. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие экспрессию флуоресцентного белка-репортера в нейронах толстых срезов мозга с высоким разрешением с помощью эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как изготовление тонких срезов, серийная флуоресцентная микроскопия или многофотонная визуализация, является то, что она гораздо быстрее, менее трудозатратна и не требует дорогостоящего или сложного оборудования для микроскопии. Для начала возьмите ткань головного мозга мыши, прошедшую фиксацию NC two путем кардиальной перфузии и подвергнутую постфиксации в течение одного-двух часов при 4 °C. Затем приготовьте 2% раствор агарозы с высокой прочностью и низкой точкой гелеобразования в PBS и нагрейте в микроволновой печи до полного растворения.

Перенесите расплавленный agarose в пробирку и поместите ее в термоблок при 40 °C для стабилизации температуры. Пока agarose остывает, приклейте фиксированную ткань мозга к поршню шприца для образцов. Используя клей Sano Aate, погрузите закрепленную ткань в насыщенный раствор сахарозы в PBS для покрытия поверхности мозга, а затем опустите поршень в корпус поршневого механизма. С помощью пипетки залейте теплый agarose в поршень, полностью покрывая ткань мозга, следя за тем, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха.

Наконец, зафиксируйте шприц с образцом с помощью блока охлаждения примерно на одну минуту. Чтобы настроить aros, установите шприц с образцом, содержащим внедренную ткань мозга, в сжатый держатель (compressed home). Расположите край лезвия вплотную к выходу шприца с образцом, затем заполните резервуар для буфера раствором PBS.

Поворачивайте микрометр. Передвигайте его вперед на величину толщины одного среза, чтобы выдавить включенную в блок ткань мозга из шприца с образцом. Для получения первого среза нажмите кнопку «Пуск» (start) на блоке управления.

Повторяйте процесс подачи включенной в парафин ткани и нажатия кнопки пуска до получения необходимого количества срезов. Соберите срезы с помощью переносной пипетки и перенесите их в стеклянный флакон для ингаляций, заполненный PBS. С помощью пипетки удалите большую часть PBS из емкости со срезами и замените его 10% раствором глицерина в PBS. Осторожно перемешивайте содержимое флакона при температуре 4 °C на настольном ротационном шейкере до тех пор, пока срезы не опустятся на дно.

Продолжайте постепенную очистку, повторяя процесс декантации и наполнения растворами глицерина с концентрацией 25%, 50% и затем 75%. Отпипетируйте 75% раствор глицерина и замените его 90% раствором глицерина. Осторожно, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха, доведите систему до равновесия при температуре four degrees Celsius, используя осторожное покачивание.

После того как срезы были максимально просветлены, они перестанут тонуть и обретут нейтральную плавучесть. С помощью пинцета вырежьте из двухстороннего адгезива открытый прямоугольник с рамкой шириной 2–3 мм, чтобы он соответствовал видимой области предметного стекла размером 25 × 75 мм. Расположите срезы мозга на стекле внутри этой рамки.

Осторожно опустите покровное стекло на клейкую ленту. Стараясь не допустить образования пузырьков воздуха и не оказывая избыточного давления для обеспечения герметичности, аспирируйте излишки глицерина, после чего загерметизируйте края покровного стекла с помощью бесцветного лака для ногтей. После высыхания герметика предметное стекло можно хранить в контейнере для стекол при температуре 4 °C или приступить к получению изображений.

Сразу после этого используйте эпифлуоресцентную микроскопию. Паттерн экспрессии вирусного вектора, экспрессирующего усиленный GFP, можно наблюдать в корональном срезе ткани мозга мыши толщиной 200 µm. Здесь выделенная область эпифлуоресцентного изображения представлена с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии для визуализации отдельных нейронов пятого слоя коры.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать фиксированные толстые срезы мозга для быстрого флуоресцентного имиджинга с высоким разрешением.