Оценка наночастиц в опухоли в реальном времени с помощью Прижизненные изображения

Общая цель данной процедуры заключается в количественной оценке поглощения наночастиц опухолями с помощью прижизненной визуализации. Для этого сначала проводят дешеллинг и культивирование куриных эмбрионов. На втором этапе в хориоаллантоическую мембрану (CAM) имплантируют ксенографты опухолей и дают им расти в течение примерно одной недели.

Третьим этапом процедуры является внутривенное введение наночастиц в камеру и проведение интравитальной конфокальной визуализации ксенографта опухоли в режиме реального времени. Заключительным этапом процедуры является иссечение и секционирование опухоли. В конечном итоге по полученным изображениям количественно оценивается поглощение наночастиц опухолью, после чего может быть проведен вторичный анализ опухоли.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами является возможность получения изображений с высоким разрешением для оценки динамики накопления наночастиц в опухолях на микроскопическом уровне. Кроме того, использование данной модельной системы позволяет одному исследователю проанализировать очень большое количество экспериментальных групп в течение двух недель. Кроме того, хорион эмбрионов Shells легко доступен для физического манипулирования и неинвазивной визуализации.

Моя лаборатория сосредоточена на разработке наночастиц для таргетной молекулярной визуализации и доставки лекарств при раке. Поиск быстрой и недорогой модели ксенотрансплантата для проведения детального анализа поглощения привел нас к использованию куриного эмбриона в скорлупе. В данной работе мы применяем intravital-визуализацию высокого разрешения для оценки поглощения наночастиц ксенотрансплантатами опухолей человека в модифицированной модели куриного эмбриона в скорлупе.

Для данного протокола подготовьте оплодотворенные куриные эмбрионы на четвертый день развития. Используя стандартный метод, убедитесь, что эмбрионы оплодотворены и жизнеспособны, проверив наличие сердцебиения; инкубируйте их при температуре 38 °C и относительной влажности не менее 60% до девятого дня эмбрионального развития, после чего эмбрионы будут готовы к инокуляции опухолевых клеток.

Соберите микроинжектор, соединив иглу 18 G со шприцем объемом 1 мл с помощью отрезка трубки Tygon длиной от 5 до 6 дюймов. Осторожно вставьте срез иглы в трубку. Примерно 4–5 дюймов трубки должно выступать за кончик иглы.

Теперь наберите суспензию опухолевых клеток через трубку в шприц и переверните его. Осторожно постучите по стенке шприца и нажмите на plunger, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Затем установите стеклянную иглу для микроинъекций на конец трубки и нажимайте на plunger до тех пор, пока суспензия клеток не достигнет кончика иглы.

Теперь под диссекционным микроскопом медленно и осторожно введите от 10 000 до 100 000 раковых клеток в интерстициальное пространство внутри камеры. Клетки должны образовать видимый болюс внутри камеры; клетки, попавшие на поверхность камеры, можно удалить, аккуратно промакнув их салфеткой Kimwipe или ватным аппликатором. Теперь верните эмбрионы в инкубатор при температуре 38 °C и влажности не менее 60%.

Оставляйте опухоль расти и васкуляризироваться до семи дней, пока ее диаметр не достигнет минимум 5 mm. Перед визуализацией наночастицы необходимо пометить флуоресцентным красителем, совместимым с интравитальным микроскопом; храните их при 4 °C в PBS, где они остаются стабильными в течение как минимум одного года. Затем центрифугируйте наночастицы в течение одной минуты для осаждения любых агрегатов перед их набором в микроинжектор. Теперь, используя PBS для разведения наночастиц, приготовьте рабочую концентрацию 1 mg/mL, чтобы в итоге ввести 50 µg наночастиц в объеме 50 µL.

Теперь перейдите к инъекциям на 16-й день эмбрионального развития. Убедитесь, что опухоли достаточно васкуляризированы, чтобы отобрать наилучшие эмбрионы с опухолями для внутривенного введения. Введите флуоресцентный декстрин с низким молекулярным весом, спектр которого отличается от спектров опухолевых клеток и наночастиц.

Затем визуализируйте декстрин с помощью флуоресцентного микроскопа и выберите эмбрионы с наиболее васкуляризированными опухолями. После выбора эмбрионов с помощью подготовленного микроинъектора введите не менее 200 µL подготовленных наночастиц. Переверните шприц.

Осторожно постучите по стенке и нажмите на поршень, чтобы удалить пузырьки воздуха. Теперь вставьте длинную коническую стеклянную микроинъекционную иглу в конец трубки и нажимайте на поршень до тех пор, пока раствор наночастиц не достигнет кончика иглы. Тупая игла не сможет проколоть эктодерму, а слишком острая и тонкая игла сломается при введении в ткань.

Затем внутривенно введите от 30 до 200 мкл наночастиц в эмбрионы в области, удаленной от стороны, которую необходимо визуализировать; сразу после введения наночастиц проведите визуализацию. Опухоли, описанные в следующем разделе, начинают подготавливать блок для визуализации эмбрионов. Сначала нанесите тонкий слой вакуумной смазки по окружности порта визуализации на нижней стороне крышки.

Затем установите стеклянный покровное стекло диаметром 18 миллиметров в порт. Теперь поместите эмбрион в устройство так, чтобы покровное стекло находилось над нужной областью для визуализации. Медленно опустите крышку устройства, пока покровное стекло не коснется эмбриона, и закрутите крышку до упора.

Теперь поместите чашку с эмбрионом в модуль визуализации, наполнив его водой с температурой 37 °C. Этот модуль будет фиксировать эмбрион в неподвижном положении под спиннинговым дисковым конфокальным флуоресцентным микроскопом. Убедитесь, что температура в термокамере составляет 37 °C.

Теперь установите блок визуализации на предметный столик так, чтобы окно покровного стекла находилось непосредственно под объективом микроскопа, и приступите к съемке. Получайте стеки изображений опухоли и окружающей сосудистой сети с высоким разрешением сразу после инъекции и далее с интервалом в один час.

После этого на изображениях будут видны детальные структурные изменения, происходящие в сосудистой сети опухоли. Эмбрион можно визуализировать непрерывно в течение до 36 часов без необходимости смены водяной бани. Для количественной оценки поглощения вирусных наночастиц по полученным изображениям используйте такой пакет программного обеспечения, как velocity.

Сначала выберите опухоль и отделите ее от окружающей стромы. Выделение облегчается путем маркировки опухоли флуоресцентным декстрином. Теперь рассчитайте средний флуоресцентный сигнал от наночастиц в опухоли и в репрезентативных областях прилегающей стромы.

Затем рассчитайте отношение среднего сигнала. Усильте выделение опухоли по среднему сигналу. Усильте выделение стромы.

Отношение больше единицы указывает на преимущественную локализацию наночастиц в опухоли. Клетки колоректального рака HT 29 вводили для формирования болюса диаметром примерно один миллиметр в камеру на девятый день. Куриным эмбрионам после семи дней инкубации вводили внутривенно низкомолекулярный декстрин для подтверждения васкуляризации опухоли.

Внутривенное введение наночастиц CPMV LOR 6 47 или пегилированных наночастиц CPMV LOR 6 47 с последующей конфокальной визуализацией в режиме реального времени с высоким разрешением показало, что оба типа наночастиц (CPMV и пегилированные CPMV) быстро маркируют всю сосудистую сеть. В течение 12 часов после инъекции количественный анализ флуоресцентного сигнала в областях опухоли и стромы показал, что поглощение пегилированных CPMV опухолью было примерно в три раза выше, чем поглощение CPMV. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как проводить интравитальную визуализацию с высоким разрешением для оценки поглощения наночастиц в ксенографтах опухоли на модели эмбриона птицы: от подготовки эмбрионов птиц и ксенотрансплантации опухолевых клеток до внутривенного введения наночастиц и оценки их поглощения опухолями с помощью интравитальной конфокальной визуализации в режиме реального времени.