Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

Общая цель следующего эксперимента заключается в идентификации предшественников эритроцитов непосредственно в свежезабранной ткани мышей. Это позволяет изучать их молекулярные свойства в периоды, когда эритропоэтическая система этих мышей претерпевает изменения. Например, во время эмбрионального развития или в ответ на гипоксический стресс сначала изолируют гемопоэтическую ткань из плодной печени, селезенки или костного мозга взрослых мышей и диссоциируют её до состояния суспензии единичных клеток.

Затем клетки маркируют антителами к маркерам клеточной поверхности CD 71 и TER 119, а также любыми другими интересующими маркерами — например, для оценки выживаемости клеток или стадии клеточного цикла. Затем суспензию маркированных клеток анализируют с помощью проточного цитометра и идентифицируют специфические субпопуляции эритробластов на различных стадиях созревания. Эти специфические субпопуляции могут быть выделены методом сортинга клеток. Впоследствии для каждой субпопуляции созревающих эритробластов может быть проведен клеточный и молекулярный анализ.

Возможность идентификации эритробластов на определенных стадиях созревания непосредственно в свежевыделенных гемопоэтических тканях дает нам возможность изучать клетки в физиологической коре. Таким образом, данный метод позволяет изучать эритробласты разных стадий созревания, реагирующие in vivo. Когда мыши подвергаются воздействию стимулов, скорость эритропоэза ускоряется.

Например, гипоксические условия, имитирующие высокогорье, или инъекции гормона эритропоэтина. Мы используем многопараметрическую проточную цитометрию для идентификации бластов в сложной тканевой среде и одновременного изучения сигнальных путей их выживания и статуса клеточного цикла. Мы также можем сортировать эритробласты конкретных стадий созревания непосредственно из свежей ткани и исследовать уровни экспрессии их генов, состояние хроматина или другие молекулярные функции.

Окончательный эритропоэз у мышей происходит в селезенке и костном мозге взрослой мыши. Следовательно, эти ткани будут извлечены из эвтаназированной мыши. После эвтаназии мыши возьмите кровь путем пункции сердца в пробирки для сбора крови с ЭДТА или гепарином; эта кровь будет использована позже для определения гематокрита, подсчета ретикулоцитов или общего анализа крови.

Поместите извлеченную селезенку и бедренную кость в отдельные пробирки с холодным буфером для окрашивания. При необходимости держите извлеченные ткани на льду. Взвесьте селезенку.

У мышей, находящихся в состоянии эритропоэтического стрессового ответа, вероятно, будет наблюдаться значительное увеличение массы селезенки. Впоследствии из полученных тканей подготавливают клетки селезенки и костного мозга по процедурам, описанным ранее для эмбриона мыши. Окончательный эритропоэз происходит в печени плода в период между 12,5 и 15,5 эмбриональными днями.

Беременные самки мышей с известным сроком беременности подготавливают для получения клеток печени плода на 12,5–14,5 дни беременности. Беременных самок мышей усыпляют, и рога матки извлекают в чашку Петри, содержащую лед. Холодная культуральная среда или окрашивающий буфер.

Для препарирования печени плода на 12,5 эмбриональный день или более ранних стадиях, а также для извлечения эмбрионов из матки, требуется использовать диссекционный микроскоп. Сначала отделите каждую эмбриональную единицу от рога матки. Затем аккуратно иссеките стенку матки, чтобы высвободить эмбрион, находящийся в амниотическом пузыре.

Осторожно отделите амниотическую мембрану. Печень плода представляет собой самую большую красную ткань брюшной полости, расположенную под гораздо более маленьким сердцем. Чтобы извлечь печень плода, используйте пинцет, чтобы зафиксировать эмбрион по обе стороны от печени, и осторожно вытолкните печень из брюшной полости в среду.

Осторожно перенесите печень в пробирку со свежим буфером для окрашивания. После того как все плодowe печени будут препарированы и перенесены в пробирки со свежим буфером для окрашивания, механически диссоциируйте печень путем пипетирования, затем профильтруйте диссоциированные клетки через нейлоновый сетчатый фильтр с размером пор 40 micron. Промойте клетки дважды путем центрифугирования, удаляя супернатант и ресуспендируя осадок в буфере для окрашивания.

После второй промывки окрасьте клетки трипановым синим и подсчитайте их с помощью гемоцитометра. Печень плода на стадии E 13.5 содержит примерно 10⁷ клеток. Ресуспендируйте клетки в концентрации от 1 до 2 × 10⁶ клеток на 200 µL образца для проведения проточного цитометрического анализа.

Для целей данного видеопротокола окрашивание антителами для проточной цитометрии будет продемонстрировано только на клетках фетальной печени. Для начала данной процедуры приготовьте предварительную смесь для окрашивания первичными антителами, содержащую следующее: очищенный rabbit IgG для блокирования FC-рецепторов в клетках мыши, CD 71 FETR one 19 PE и антитела, направленные против белка клеточной поверхности fast. Аккуратно перемешайте раствор антител, перевернув пробирку два-три раза, добавьте 200 µL предварительной смеси для окрашивания первичными антителами к ранее подготовленному образцу клеток фетальной печени и осторожно перемешайте содержимое, несколько раз прокачав жидкость через пипетку для ресуспендирования клеток.

Затем подготовьте эти шесть контрольных образцов клеток. Неокрашенный образец, в котором клетки выдерживаются в буфере для окрашивания, чтобы определить фоновую автофлуоресценцию клеток; одноцветный контроль для каждого антитела или красителя, используемого в протоколе, для коррекции спектрального перекрытия между каналами, которыми в данном эксперименте являются TUR one 19 PE CD 71 fz fast, биотин и стрептавидин A PC; и контроль Fluorescence Minus One (FMO) для fast biotin, который позволяет определить истинный фон для этого канала, где клетки окрашены всеми цветами или антителами по протоколу, кроме fast biotin. Инкубируйте образец и соответствующие контроли с первичными антителами на льду от 45 минут до одного часа в темноте.

По окончании инкубации промойте клетки, добавив по 3 мл буфера для окрашивания в каждую пробирку с образцом, и центрифугируйте в течение 3–5 минут при приблизительно 400 ×g при температуре 4 °C. Затем добавьте стрепт-авидин и инкубируйте пробирки на льду в течение 30–45 минут. По завершении инкубации промойте клетки так же, как при окрашивании первой антителами.

Наконец, ресуспендируйте клетки в окрашивающем растворе, содержащем непроникающий в клетку краситель ДНК seven a a d для исключения мертвых клеток. Теперь образцы готовы к анализу методом проточной цитометрии. Самым сложным аспектом данной процедуры является правильный анализ гейтирования событий проточной цитометрии, позволяющий достоверно идентифицировать субпопуляции эритробластов.

Этот процесс требует тщательной настройки прибора, использования всех необходимых контрольных образцов, точной компенсации спектрального перекрытия и последующего гейтирования для исключения мертвых клеток, агрегатов и очень мелких событий. В начале анализа данных неокрашенный образец и контрольные образцы с одним красителем используются для настройки компенсации спектрального перекрытия для каждой комбинации цветов.

В данном примере мы продемонстрируем, как флуоресценция FITC перетекает в канал PE и как этот спектральный перехлест корректируется после компенсации. Сначала, используя неокрашенный контроль, мы определим область, положительную по FITC и отрицательную по PE. Затем, используя контроль с окрашиванием одним красителем FITC, мы сможем визуализировать спектральный перехлест в канал PE.

После проведения цифровой компенсации в программном обеспечении FlowJo сигнал перекрытия (spillover fit) E в канале PE минимизируется. После компенсации можно удалить мертвые клетки, агрегаты и мелкие события. Агрегаты и дублеты клеток удаляются путем построения графика зависимости высоты прямого светорассеяния от площади прямого светорассеяния и выбора событий внутри узкого диагонального гейта.

Мертвые клетки удаляются путем выбора клеток, которые являются отрицательными по окрашиванию красителем DAPI — мембранно-непроницаемым красителем для ДНК. Гейт жизнеспособных DAPI-отрицательных клеток также исключает очень мелкие события, такие как ядра или клеточный дебрис, характеризующиеся очень низким прямым светорассеянием. Далее мы продемонстрируем стратегию гейтирования для клеток печени плода.

Свежесобранные клетки были помечены CD 71 TUR one 19 и коктейлем антител, меченных ZI и направленных против маркеров неэритроидных линий. В данном примере образцы уже прошли компенсацию спектрального перекрытия, после чего было проведено гейтирование для исключения агрегатов, мертвых клеток и очень мелких событий. Мы используем образец FMO, содержащий все флуорохромы, кроме красителя для определения положительных линий, чтобы построить гистограмму fitzy и определить гейт для клеток с отрицательной экспрессией маркеров линий; затем мы применяем этот гейт к образцу клеток плода печени, окрашенному конъюгированными с ZI маркерами линий.

Линейно-отрицательные клетки отбирают и отображают на графике, где по оси Y отложены CD 71 и TER 19. По оси X клетки теперь готовы к разделению на подмножества от S0 до S5. Подмножество S0, обедненное по линейным маркерам, в основном содержит клетки с потенциалом CFUE до возникновения зависимости от EPO.

Подмножество S1 содержит EPO-зависимые CFUE-клетки, находящиеся преимущественно в S-фазе клеточного цикла. Клетки подмножества S2 утратили способность к формированию колоний и начинают экспрессировать гемоглобин. Клетки подмножества S3 представляют собой преимущественно базофильные эритробласты. Подмножества S4 и S5 содержат поздние эритробласты. Здесь представлена стратегия анализа после сбора данных о клетках селезенки, обработанных и маркированных антителами к CD 71 и TER 19, а также гистограмма рецептора смерти fast.

На одном графике отображены все зарегистрированные события, где диагональный гейт представляет события, которые, вероятно, являются одиночными клетками, за исключением дуплетов или более крупных агрегатов. Клетки в этом гейте далее анализируются на гистограмме два. Очень мелкие события, вероятно, представляющие собой ядра или клеточный детрит, исключаются.

Отсеянные клетки показаны на гистограмме три, где DAPI-положительные клетки, которые, вероятно, являются апоптотическими клетками с проницаемой мембраной, исключены из дальнейшего анализа. Гистограмма четыре показывает resulting популяцию жизнеспособных клеток селезенки. Предварительный гейт (pro eGate) содержит CD 71 high TER 1.19 Intermediate клетки; клетки TER 1.19 high подвергаются дальнейшему анализу на гистограмме пять.

Здесь клетки с высоким уровнем экспрессии CD 71 подразделяются на менее зрелые эритробласты с большой площадью A и более мелкие, более зрелые эритробласты B. Наиболее зрелым подмножеством эритробластов является C. Экспрессия белков клеточной поверхности для каждого из этих подмножеств может быть измерена одновременно путем добавления соответствующих антител вместе с TER 19 и CD 71. Гистограмма окрашивания 6 показывает экспрессию рецептора смерти Fas на поверхности клеток, конкретно в подмножестве A, у мышей в базовом состоянии и у мышей, получивших однократную дозу Epo.

Результаты указывают на то, что EPO подавляет быструю экспрессию в данной области. Также может быть измерена экспрессия внутриклеточных белков in vivo или статус клеточного цикла для клеток в каждой подгруппе. В данном репрезентативном анализе клеточного цикла мышам вводили BRDU внутрибрюшинно, а костный мозг собирали через 30–60 минут.

Помимо окрашивания на CD 71 и TER one 19, клетки окрашивали на включение BRDU в реплицирующуюся ДНК; BRDU-положительные клетки находятся в S-фазе цикла. Интерфазные клетки являются BRDU-отрицательными и могут быть разделены на фазы G one или G two M. С помощью DNAD seven A A D клетки могут быть отсортированы из каждой из подгрупп PRO E area A A B и A EC.

Здесь они представлены в препаратах цитозина, демонстрирующих последовательное созревание с уменьшением размера клеток, конденсацией ядер и усилением коричневого окрашивания, что отражает экспрессию гемоглобина. Наконец, здесь показан репрезентативный анализ клеточного цикла подмножества S3 в фетальной печени на стадии E 13.5. Беременным мышам вводили BRDU.

Печень плодов извлекали через 30–60 минут, затем фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали антителами к CD 71, TER 1-19 и BrDU. Анализировали стадию клеточного цикла клеток S3, где клетки S-фазы являются BrDU-положительными, а содержание ДНК определяли путем окрашивания красителем ДНК 7-AAD.

Описанный нами цитометрический подход позволяет одновременно исследовать такие клеточные функции, как экспрессия маркеров клеточной поверхности и других белков, выживаемость клеток, передача клеточных сигналов с использованием специфических антител и статус клеточного цикла. Это позволяет нам изучать молекулярные ответы эритробластов — клеток на определенной стадии созревания — на широкий спектр стимулов или эффект генетических мутаций. Следует отметить, что субпопуляции созревающих клеток при проточной цитометрии определяются на основании экспрессии маркеров клеточной поверхности и прямого светорассеяния.

Мы обнаружили, что в целом клетки в каждом подмножестве соответствуют схожей морфологической стадии эритробласта в широком спектре моделей мышей. Тем не менее, мы рекомендуем проверять это при изучении новой модели мышей. Для анализа морфологии можно провести сортировку клеток из каждого подмножества; таким же образом клетки из каждого подмножества могут быть отсортированы для анализа РНК или транскриптома. В экспериментах по сортировке следует использовать низкое давление сортировки и широкие сопла, чтобы минимизировать воздействие напряжения сдвига на клетки.

Мы также рекомендуем проверять чистоту и жизнеспособность клеток после каждого эксперимента по сортингу. Наконец, при обнаружении изменения частоты определенной субпопуляции важно установить, вызвано ли это истинным изменением количества клеток в данной субпопуляции или же изменениями в других субпопуляциях. Следовательно, помимо измерения частоты субпопуляций, всегда необходимо измерять и абсолютное количество клеток в каждой субпопуляции.