Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

Общая цель данного эксперимента заключается в идентификации предшественников эритроцитов непосредственно в свежесобранных тканях мышей. Это позволяет нам изучать их молекулярные свойства в периоды, когда эритропоэтическая система у этих мышей претерпевает изменения. Например, во время эмбрионального развития или во время реакции на гипоксический стресс сначала кроветворную ткань выделяют из печени плода мыши или взрослой селезенки или костного мозга и диссоциируют в одноклеточную суспензию.

Затем клетки мечут антителами к маркерам клеточной поверхности CD 71 и TER 119, а с любыми другими маркерами, представляющими интерес, например, для измерения выживаемости клеток или статуса клеточного цикла, меченую клеточную суспензию затем анализируют с помощью анализатора проточной цитометрии и идентифицируют специфические субпопуляции эритробластов на различных стадиях созревания. Эти специфические подмножества могут быть очищены путем сортировки клеток. Впоследствии может быть проведен клеточный и молекулярный анализ для каждой подгруппы созревания эритробластов.

Возможность идентификации эритробластов на определенных стадиях созревания непосредственно в свежевыделенных кроветворных тканях дает нам возможность изучать клетки физиологической коры. Таким образом, этот метод позволяет нам изучать высокие эритробласты разных стадий созревания, реагировать in vivo. Когда мыши подвергаются воздействию раздражителей, они ускоряют эритропоэтическую обрешетку.

Например, гипоксические состояния, которые имитируют большую высоту или инъекцию гормона эритропоэтина. Мы используем многопараметрическую проточную цитометрию для идентификации blats в сложной тканевой среде и одновременного изучения их сигнальной выживаемости и состояния клеточного цикла. Мы также можем сортировать эритробласты на конкретных стадиях созревания непосредственно из свежих тканей и исследовать уровни экспрессии их генов, статус хроматина или другие молекулярные функции.

Дефинитивный эритропоэз у мышей происходит в селезенке и костном мозге взрослой мыши. Следовательно, эти ткани будут собраны у усыпленной мыши. После усыпления мыши, забор крови с помощью пункции сердца в пробирки для сбора крови с ЭДТА или гепарином, эта кровь позже будет использована для подсчета гематокрита, ретикулоцитов или анализа общего анализа крови.

Собранную селезенку и бедренную кость поместите в отдельные пробирки, содержащие холодное окрашивание. Буфер. При желании храните заготовленные салфетки на льду. Взвесьте селезенку.

У мышей, испытывающих эритропоэтическую реакцию на стресс, вероятно, будет наблюдаться значительное увеличение массы селезенки. Впоследствии клетки селезенки и клетки костного мозга получают из собранных тканей с помощью процедур, ранее продемонстрированных на эмбрионе мыши. Окончательный эритропоэз происходит в печени плода между 12,5 и 15,5 днями эмбриона.

Беременных самок мышей готовят к получению фетальных клеток печени на 12,5-14,5 день беременности. Беременных самок мышей усыпляют, а рога матки удаляют в чашку Петри, содержащую лед. Холодная питательная среда или буфер для окрашивания.

Препарирующий микроскоп необходим для препарирования печени плода с эмбрионального дня 12,5 дня или младше для извлечения эмбрионов из матки. Сначала отделите каждую бусину от рога. Затем аккуратно иссекайте стенку матки, чтобы освободить эмбрион, который находится в ее амниотическом мешке.

Аккуратно снимите околоплодные околоплодные оболочки. Печень плода — это самая большая красная ткань брюшной полости, расположенная под гораздо меньшим сердцем. Чтобы рассечь печень плода, с помощью щипцов обездвижите эмбрион с обеих сторон печени и аккуратно вытолкните печень из брюшной полости в среду.

Аккуратно переложите печень в трубку, содержащую свежий красящий буфер. После того, как печень плода была рассечена и перенесена в пробирку, содержащую свежее окрашивание. Буфер механически диссоциирует печень путем пипетирования, затем дважды фильтрует диссоциированные клетки через нейлоновую сетку размером 40 микрон с помощью центрифугирования, отбрасывая надосадочную жидкость и суспензию в окрашивающем буфере.

После второго промывки окрашивают клетки триановым синим и подсчитывают с помощью гемоцитометра. Печень плода при Е 13,5 имеет от 10 до седьмого. Клетки ресуспендируют клетки в соотношении один-два раза от 10 до шестой клетки на 200 микролитров образца для проточного цитометрического анализа.

Для целей данного видеопротокола окрашивание антителами для проточной цитометрии будет продемонстрировано только на клетках печени плода. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте первичный премикс для окрашивания антителами, содержащий следующий очищенный кроличий IgG для блокирования рецепторов FC в клетках мыши CD 71 FETR one 19 PE и антитело, направленное на белок клеточной поверхности. Осторожно перемешайте раствор антитела, перевернув пробирку два-три раза, добавьте 200 микролитров первичного окрашивающего антитела, предварительно смешанного с предварительно подготовленным образцом клеток печени плода и осторожно пипеткой вверх и вниз для ресуспендирования клеток.

Далее подготовьте эти шесть образцов контрольных клеток. Неокрашенный образец, в котором клетки оставлены в окрашивающем буфере для обеспечения фоновой автофлуоресценции клеток, одним цветом для каждого антитела или цветом, используемым в протоколе для коррекции спектрального перекрытия между каналами, которые в данном эксперименте представляют собой TUR one 19 PE CD 71 fz fast, биотин и стрептавидин A PC и семь A A DA флуоресценции минус один контроль для быстрого биотина, который обеспечивает истинный фон для того канала, где клетки окрашиваются всеми цветами или антителами из протокола, за исключением быстрого биотина. Инкубируйте образец и соответствующий контроль в окрашивании первичных антител на льду в течение от 45 минут до одного часа в темноте.

В конце инкубации промойте клетки, добавив три миллилитра буфера для окрашивания в каждую пробирку с образцом, и вращайте в течение трех-пяти минут при температуре примерно в 400 раз сильнее силы тяжести при четырех градусах Цельсия. Затем нанесите стрептококк в ПК и инкубируйте трубки на льду в течение 30-45 минут. По завершению инкубации промойте клетки как для первого окрашивания антителами.

Наконец, повторно суспендируйте клетки в окрашивающем растворе, содержащем непроницаемый для клетки краситель ДНК 7 a d для исключения мертвых клеток. Теперь образцы готовы к анализу проточной цитометрии. Наиболее сложным аспектом этой процедуры является правильный гейт-анализ проточных цитометрических событий, позволяющий надежно идентифицировать субпопуляции эритробластов.

Для этого требуется тщательная настройка всех правильных контрольных образцов, тщательная компенсация спектрального перекрытия и последующее стробирование, исключающее мертвые ячейки, агрегаты и очень малые события. На старте анализа данных. Неокрашенный образец и контрольный образец одного цвета используются для настройки компенсации спектрального перекрытия для каждой цветовой комбинации.

В этом примере мы покажем, как флуоресценция fit e проникает в канал PE и как это спектральное перекрытие корректируется после компенсации. Во-первых, используя неокрашенный контроль, мы определяем положительную и отрицательную область PE. Далее, используя одноцветное управление Fit E, мы можем визуализировать спектральное перетекание в PE-канал.

После цифровой компенсации с помощью программного обеспечения FlowJo сигнал подгонки E в канале PE сводится к минимуму. После компенсации мертвые клетки, агрегаты и мелкие события могут быть удалены. Агрегаты и дублеты ячеек удаляются путем построения графика прямой высоты рассеяния в зависимости от прямой области рассеяния и выбора событий в пределах узкого диагонального вентиля.

Мертвые клетки удаляются путем отбора клеток с отрицательным результатом на dapi A Клеточная непроницаемая ДНК погибает. Отрицательные жизнеспособные клеточные ворота DAPI также исключают очень малые события, такие как ядра или обломки, которые имеют очень низкий прямой разброс. Далее мы покажем стратегию стробирования для клеток печени плода.

Свежесобранные клетки были помечены для CD 71 TUR one 19, а коктейль меченных ZI антител был направлен на маркеры неэритроидной линии. В этом примере образцы уже были компенсированы на спектральное перекрытие, а затем стробированы, чтобы исключить агрегаты, мертвые клетки и очень малые события. Мы используем образец FMO, который содержит все цвета, кроме положительного окрашивания фитзи, чтобы построить гистограмму фитзи и определить генеалогические отрицательные клеточные ворота, затем мы применяем эти ворота к образцу клеток печени плода, который был окрашен конъюгированными маркерами линии ZI.

Отбираются линейно-отрицательные ячейки и наносятся на график с CD 71 по оси Y и TER единицей 19. На оси A ячейки теперь готовы к разделению на подмножества от S нуля до S 5. Истощенное S-нулевое подмножество Линя в основном содержит клетки с потенциалом КОЕ до начала зависимости от ЭПО.

S-1 подгруппа содержит ЭПО-зависимые КФУЭ ячейки в основном в S-фазе клеточного цикла. S-две субпопуляции клетки утратили колониеобразующий потенциал и начинают экспрессировать гемоглобин S3-субпопуляции в основном базофильные Эритробласты S4 и S-5 субпопуляции содержат поздние эритробласты. Здесь показана стратегия анализа после получения данных от клеток селезенки, обработанных и меченных антителами, направленными на CD 71 и TER one 19, а также быстрой гистограммы рецептора смерти.

Один показывает все полученные события, где диагональный вентиль представляет события, которые, скорее всего, являются отдельными ячейками, за исключением дублетов или более крупных агрегатов. Клетки в этом затворе более подробно анализируются на гистограмме номер два. Очень малые события, вероятные ядра или обломки, исключаются.

Закрытые клетки показаны на гистограмме 3, где DAPI-положительные клетки, которые, вероятно, являются мембранопроницаемыми апоптотическими клетками, исключены из дальнейшего анализа. На четвертой гистограмме показана результирующая популяция жизнеспособных клеток селезенки. pro eGate содержит CD 71 высокий TER один 19 промежуточных клеток tur R один 19 высоких клеток дополнительно анализируются на гистограмме 5.

Здесь высокие клетки CD 71 подразделяются на менее зрелые большие площади, эритробласты А и более мелкие, более зрелые эритробласты А В. Наиболее зрелой субпопуляцией эритробластов является ARI C. Экспрессия белков клеточной поверхности может быть измерена одновременно для каждой из этих субпопуляций путем добавления соответствующих антител одновременно с TER R one 19 и CD 71. Окрашивание гистограммы 6 показывает экспрессию рецептора смерти на клеточной поверхности быстро, особенно в области подгруппы А у мышей в базальном состоянии и мышей, которым вводили одну дозу E. ppo.

Результаты показывают, что ЭПО подавляет быструю экспрессию в этой области. Популяционная экспрессия внутриклеточных белков in vivo или статус клеточного цикла также могут быть измерены для клеток в каждой подгруппе. В этом репрезентативном анализе клеточного цикла мышам вводили BRDU внутрибрюшинно, а костный мозг собирали через 30-60 минут.

В дополнение к окрашиванию на CD 71 и TER one 19, клетки окрашивали на включение BRDU в их реплицирующиеся D-N-A-B-R-D-U положительные клетки, находящиеся в S-фазе цикла. Ячейки интерфейса являются BRDU-отрицательными и могут быть разложены на G одну или G две M фазы. С помощью DNAD можно отсортировать семь A, A, D-клеток из каждого из подмножеств PRO, E, A, A, EC и A, EC.

Здесь они представлены в препаратах цитозина, демонстрирующих последовательное созревание с уменьшением размера клеток, конденсацией ядер и увеличением коричневой окраски, отражающей экспрессию гемоглобина. Наконец, здесь представлен репрезентативный анализ клеточного цикла субпопуляции S3 в печени плода E 13.5. Беременным мышам вводили BRDU.

Печень плода собирали через 30-60 минут, фиксировали перму и окрашивали антителами против CD 71, TER one 19 и BRDU. Состояние клеточного цикла S3-клеток анализируется там, где находятся клетки S-фазы. Положительный BRDU и содержание ДНК количественно определяют путем окрашивания для ДНК-красителя семь A a d.

Описываемый нами цитометрический подход позволяет одновременно исследовать клеточные функции, такие как экспрессия маркеров клеточной поверхности и других белков, клеточная сигнализация выживаемости клеток с использованием фоссоспецифических антител и статус клеточного цикла. Таким образом, это позволяет нам исследовать молекулярные реакции эритробластов, различную стадию созревания на широкий спектр стимулов или влияние генетических мутаций. Следует отметить, что подмножества созревания проточной цитометрии определяются с точки зрения экспрессии маркеров клеточной поверхности и прямого рассеяния.

Мы обнаружили, что в целом клетки в каждой подгруппе соответствуют сходной морфологической стадии эритробластов в самых разных моделях мышей. Тем не менее, мы рекомендуем проверить это при рассмотрении новой модели мыши. Сортируя клетки из каждого подмножества и изучая их морфологию, клетки из каждого подмножества также могут быть отсортированы для анализа РНК или транскриптома: в экспериментах по сортировке используется низкое давление сортировки и широкие носы, чтобы свести к минимуму явное напряжение клеток.

Мы также рекомендуем проверять чистоту и жизнеспособность клеток после каждого эксперимента по сортировке. Наконец, при обнаружении изменения частоты данного подмножества важно определить, связано ли это с истинным изменением количества клеток в этом подмножестве или с изменениями в других подмножествах. Таким образом, в дополнение к измерению частот подмножества, всегда необходимо также измерять абсолютное число ячеек в каждом подмножестве.