Трансдукция клеток человека с Полимер-комплекс Ecotropic лентивирус для работы с улучшенными биобезопасности

Общая цель следующего эксперимента заключается в введении онкогенов или других потенциально опасных генов в клетки человека с использованием эхотропного лентивируса. Это достигается путем получения пантропного лентивируса, кодирующего рецептор мышиного ретровируса, а также эхотропного лентивируса, кодирующего интересующий ген; клетки трансдуцируют рецептором мышиного ретровируса, что делает их восприимчивыми к трансдукции эхотропным вирусом. Затем клетки трансдуцируют эхотропным вирусом для введения онкогена, используя полимерную комплексацию с поли-L-лизином и хондроитинсульфатом для усиления трансдукции; результаты, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (FACS), демонстрируют селективную трансдукцию клеток человека тропным лентивирусом.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как гамма-ретровирусная трансдукция, является то, что лентивирусные частицы могут более эффективно трансдуцировать многие типы клеток, включая неделящиеся клетки, такие как стволовые клетки. Этот метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области исследований рака и стволовых клеток, например, в понимании функций потенциальных онкогенов. Перед началом данной процедуры проконсультируйтесь со специалистом по технике безопасности вашего учреждения и следуйте рекомендованным ими правилам безопасности.

Начиная работу в ламинарном шкафу для культивирования тканей, используйте культуру здоровых быстрорастущих клеток 2 9 3 T. В асептических условиях ресуспендируйте 5 × 10⁶ клеток 2 9 3 T в 10 мл среды для клеток 2 9 3 T без антибиотиков. Перенесите суспензию клеток пипеткой в 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей и инкубируйте чашку в течение ночи в инкубаторе для культур тканей при 37 °C и 5% carbon dioxide.

На следующий день, во второй половине дня, приступите к трансфекции. Сначала возьмите аликвоты Optum, а также плазмид трансфертной упаковки и конверта и дайте им прогреться до комнатной температуры; перенесите 375 µL Optum в микроцентрифужную пробирку, затем добавьте 25 µL реагента для трансфекции FuGENE HD. Убедитесь, что реагент FuGENE дозирован непосредственно в среду и не касается стенок пробирки.

Затем во второй микроцентрифужной пробирке смешайте 5 µg трансфертной плазмиды, 3,75 µg упаковочной плазмиды и 1,25 µg плазмиды оболочки в необходимом количестве Opti-MEM, чтобы довести объем до 100 µL. Затем добавьте смесь Opti-Fuji в пробирку с плазмидами и инкубируйте при комнатной температуре от 20 до 30 минут. За несколько минут до окончания инкубации очень осторожно аспирируйте среду из планшета с клетками 293T и замените ее 10 mL свежей среды для клеток 293T без антибиотиков.

Наконец, по каплям добавьте смесь плазмид с геном FU в среду в чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Поместите чашку в инкубатор для культур тканей, настроенный на 37 °C и 5% CO2, и инкубируйте в течение ночи. На следующий день осторожно аспирируйте среду из чашки и замените ее свежей средой для клеток 2 9 3 T без антибиотиков.

Затем верните планшет в инкубатор для культур тканей и инкубируйте еще в течение двух дней. Через три дня после трансфекции аспирируйте с планшета среду, содержащую вирус, и профильтруйте её через фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,45 мкм. После фильтрации титруйте вирус для определения его титра, затем приготовьте серию разведений контрольного флуоресцентного вируса в свежей среде без антибиотиков с добавлением 6 мкг/мл полибрена и используйте эти разведения для трансдукции клеток соответствующей клеточной линии. На следующий день замените среду в 24-луночном планшете на свежую среду без антибиотиков и продолжайте инкубацию еще два дня, чтобы клетки могли экспрессировать флуоресцентный белок.

Используйте полученные данные для определения доли трансдуцированных клеток для каждого разведения вируса. Затем рассчитайте титр в трансформирующих единицах на миллилитр на основе разведений, при которых уровень трансдукции составляет менее 15%, чтобы минимизировать случаи множественной трансдукции. Предполагается, что титры других нефлуоресцентных лентивирусов, полученных параллельно, аналогичны титру флуоресцентного вируса.

Для трансдукции целевых клеток начните с выбора кратности инфекции более двух, чтобы гарантировать трансдукцию большинства клеток. Сначала разведите вирусный супернатант до требуемой кратности инфекции в свежей полной культуральной среде. Добавьте полибрена в концентрации 6 µg/mL до достижения конечного объема 1 mL.

Отоберите среду из чашки диаметром 35 мм с целевыми клетками и добавьте один миллилитр разведенного вирусного супернатанта. При необходимости инкубируйте в инкубаторе для культур тканей от 24 до 48 часов для обеспечения достаточной экспрессии рецептора SLC7A1. Для селекции стабильно трансдуцированных клеток, экспрессирующих SLC7A1, используйте антибиотический отбор с помощью бластеоцина в соответствии с инструкциями, изложенными в письменном протоколе.

Для начала определения токсичности приготовьте стоковый раствор хондроитинсульфата в концентрации 20 mg/mL и стоковый раствор Poly brain в воде в концентрации 20 mg/mL, после чего подвергните их стерильной фильтрации. Излишки стоковых растворов можно хранить при температуре -20 °C до использования.

Затем определите количество клеточных культур в 96-луночных планшетах, необходимых для точного определения токсичности полимерного комплекса. С помощью MTT-теста следует протестировать как минимум шесть концентраций хондроитинсульфата и poly green в трех повторностях. Кроме того, необходимо использовать невосстановленные клетки и клетки, выращенные в безсывороточной среде.

Среду следует добавить для создания базового уровня здоровых клеток и для контроля остановки роста соответственно. После определения необходимого количества лунок посейте по 5 000 целевых клеток в каждую лунку 96-луночного планшета; параллельно посейте клетки в 24-луночный планшет для микроскопического или количественного анализа эффективности трансдукции в каждом экспериментальном условии, оставив оба набора клеток расти на ночь. На следующий день добавьте аликвоту стокового раствора хондроитинсульфата и аликвоту стокового раствора полибрена.

Затем разведите вирус, кодирующий GFP, в безantibiotic-среде, содержащей 6 мкг/мл poly brain, до кратности заражения (MOI), достаточной для трансдукции примерно 10–50% целевых клеток в каждой лунке. Убедитесь, что разведенного вируса достаточно для каждого условия теста, а также для контрольных лунок на каждой планшете. Маркируйте набор пробирок в соответствии с каждой тестируемой концентрацией хондроитинсульфата и полимера poly green.

Затем разлейте вирусную суспензию по пробиркам в объеме, достаточном для каждой из трех параллельных проб для каждого условия. Далее последовательно внесите в каждую пробирку необходимый объем стокового раствора хондроитинсульфата и поли-I:C для достижения требуемых тестовых концентраций. Сразу после добавления хондроитинсульфата и поли-I:C слегка встряхните пробирку для перемешивания.

Оставьте смеси вируса с полизеленым хондроитинсульфатом инкубироваться при комнатной температуре в течение пяти минут. Смесь может стать мутной из-за образования вирусных преципитатов. После инкубации аспирируйте среду из лунок планшета на 96 лунок.

Затем добавьте смесь вируса с хондроитинсульфатом и поли-зеленым красителем в лунки согласно плану. Также внесите контрольный образец и безсывороточную среду в соответствующие лунки. Повторите этот процесс для 24-луночного планшета и инкубируйте в инкубаторе для культур тканей в течение ночи.

Затем аспирируйте среду, содержащую вирус, из лунок и замените ее свежей средой. Верните планшеты в инкубатор на 48 часов. Через 48 часов извлеките 24-луночный планшет и используйте FACS для анализа эффективности трансдукции для каждой концентрации хондроитинсульфата и полибрейна.

На следующий день аспирируют среду из всех лунок 96-луночного планшета и заменяют её 100 µL раствора MTT. Инкубируют в течение трех часов в увлажненном инкубаторе, чтобы MTT восстановился в митохондриях метаболически активных клеток. Через три часа аспирируют раствор MTT и заменяют его 200 µL раствора растворителя.

Инкубируйте планшет в течение двух часов при комнатной температуре или до тех пор, пока не образуется весь пурпурный формазан MTT и не растворится осадок. Измерьте абсорбцию на микропланшетном ридере при 570 нанометрах, вычитая фоновое значение при 690 нанометрах. Оптимальная концентрация полимера обеспечит максимальное усиление трансдукции, определенное по факторам, при минимальном воздействии на метаболическую активность hdfs, определенную с помощью MTT.

100 µg/mL хондроитинсульфата. Poly brain представляет собой оптимальную концентрацию полимера, определенную данным методом. Сначала приготовьте достаточное количество смеси супернатанта вирусного вектора poly green и хондроитинсульфата в концентрации 100 µg/mL для трансдукции необходимого количества чашек диаметром 35 мм с клетками HDF, экспрессирующими рецептор SLC7A1. Инкубируйте смесь в течение пяти минут для формирования полимерных комплексов.

Затем аспирируйте среду из рецептора, экспрессирующего целевые клетки, и замените ее вирусной смесью; инкубируйте в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. После удаления вирусной смеси дважды промойте поверхность клеток раствором PBS, чтобы способствовать удалению вирусных комплексов. Полное удаление не обязательно, так как остаточные полимерные комплексы не оказывали отрицательного влияния на жизнеспособность клеток.

На этом изображении с флуоресцентного микроскопа показана достаточная трансдукция клеток саркомы человека, стабильно экспрессирующих SLC7A1, тропным вирусом при использовании флуоресцентных контрольных векторов для мониторинга эффективности трансдукции. Количественный анализ флуоресценции с помощью ФАПС-анализа демонстрирует эффективность трансдукции более 90%. Скорость трансдукции HDFs обычно ниже, поскольку клетки не подвергались селекции по экспрессии рецепторов; титры атропного лентивируса обычно составляют 10–20% от титров VSV-псевдотипированного вируса, измеренных на S-L-C-H-S-C. Тест на жизнеспособность MTT позволяет чувствительно обнаружить остановку роста в клетках-мишенях, что видно здесь при трансдукции вирусом в сочетании с концентрациями хондроитинсульфата.

Поли-L-лизин в концентрации до 800 мкг/мл не оказывает влияния на метаболизм HDF. FACS-анализ HDF, трансдуцированных вирусом с различными концентрациями хондроитинсульфата. Поли-L-лизин демонстрирует усиление трансдукции по сравнению с использованием только поли-L-лизина.

Максимальное усиление наблюдается при концентрации 100 µg/mL. Значения для поли-хондроитинсульфата мозга в несколько раз ниже ранее зарегистрированных. Таким образом, важно оптимизировать условия комплексообразования с хондроитинсульфатом для каждого конкретного типа клеток.

Poly brain повышает наблюдаемый титр примерно в три раза в S-L-C-H-S-C. На практике это приводит к более выраженному влиянию на эффективность трансдукции при низких концентрациях вируса, чем при высоких, что, скорее всего, обусловлено множественным заражением клеток и насыщением рецепторов при более высоких концентрациях вируса. Трансдукция тропным вирусом специфична для клеток, экспрессирующих рецептор нейронального ретровируса.

При трансдукции немодифицированных человеческих клеток тропным вирусом флуоресценция, превышающая уровень фона, не наблюдалась, что было подтверждено данными FACS-анализа и микроскопии. В клетках HDFS трансдукция отсутствует при отсутствии рецептора, в то время как предварительная трансдукция рецептором приводит к появлению флуоресцентных клеток. При выполнении данной процедуры важно убедиться, что вирус не будет трансдуцировать немодифицированные человеческие клетки.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать тропный лентивирус для доставки потенциально опасных генов в клетки человека, включая использование полимерной комплексации для повышения эффективности трансдукции.