Оценка молочной железы развития и функции в моделях мыши

Общая цель данной процедуры — оценка развития молочных желез у мышей дикого типа и мутантных мышей. Для этого сначала проводят вскрытие мыши, чтобы обнажить молочные железы. Затем молочные железы надлежащим образом извлекают и распределяют по предметным стеклам, спокойным люмом.

Затем применяется окрашивание для анализа степени развития эпителия. В завершение проводится анализ сокращения миоэпителия при воздействии окситоцина, INEA J. В конечном итоге полученные результаты позволят определить, правильно ли сформировались протоки и альвеолы молочной железы, а также способно ли миоэпителий сокращаться и выделять молоко при воздействии окситоцина. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся развития и дифференцировки молочной железы, например, о влиянии генных мутаций или нокаута на морфологию и функцию молочной железы.

Визуальная демонстрация этого метода обеспечивает правильное препарирование молочной железы, так как и закрепление в отверстиях, и анализ на основе окситоцина требуют качественно подготовленных молочных желез. Некачественное препарирование железы может привести к отсутствию некоторых эпителиальных протоков или наличию посторонних тканей, таких как кожа или мышечная ткань. Минимум за один день до препарирования приготовьте раствор квасцов CalMin, растворив 1 г CalMin и 2,5 г сульфата алюминия-калия в 500 мл дистиллированной воды.

Кипятите раствор в течение 20 минут в однолитровой колбе, затем доведите конечный объем до 500 миллилитров водой. Профильтруйте раствор через бумагу Whatman и добавьте несколько крупинок тиола в качестве консерванта. После окрашивания поместите раствор в холодильник.

Раствор карбонатных квасцов можно выливать обратно в исходный флакон и использовать многократно в течение нескольких недель. Приготовьте свежий раствор, когда цвет станет бледным. Для начала диссекции памяти желез пожертвуйте мышью, используя метод ингаляции углекислым газом.

По возможности избегайте вывиха шейных позвонков, так как это может повредить крупные кровеносные сосуды шеи и привести к скоплению крови вокруг молочной железы, что затруднит последующее препарирование на обернутом фольгой пенополистироле. Положите мышь на спину и разведите конечности в стороны.

Плотно зафиксируйте все четыре конечности с помощью игл калибра 16–20. Обильно смочите мышь 70% этанолом, используя пинцет. Поднимите кожу живота по средней линии и сделайте небольшой надрез острыми ножницами, начиная от места разреза.

Разрежьте кожу до шеи животного, стараясь не проколоть брюшную или грудную полости. Разрежьте кожу на передних конечностях до срединного разреза так, чтобы получилась Y-образная форма. Аналогично разрежьте кожу на задних конечностях.

Используя гемостатический зажим, при необходимости осторожно отодвиньте кожу живота и грудной клетки мыши в сторону. Осторожно рассеките соединительную ткань.

Закрепите кожу на пенополистироле с помощью игл калибра 16–20, открыв доступ к молочным железам, прикрепленным к нижней стороне кожи. Препарируйте каждую железу по отдельности, используя пинцет. Осторожно приподнимите нужную молочную железу и сделайте разрез между железой и кожей маленькими острыми ножницами, двигаясь от внешней стороны к позвоночнику животного.

Осуществляйте разрезы осторожно, чтобы на железе не осталось фрагментов кожи или мышц. С помощью данного протокола можно удалить любые молочные железы, однако для изготовления целых препаратов лучше всего подходят четвертые брюшные молочные железы. После извлечения молочной железы из мыши аккуратно распластайте ее непосредственно на предметном стекле.

Постарайтесь максимально распластать образец. При сохранении исходной формы in situ железа будет хорошо прилегать к предметному стеклу. После надлежащего растягивания в вытяжном шкафу зафиксируйте железу, погрузив предметное стекло в банку с карноидом.

Фиксируйте в течение четырех часов при комнатной температуре. В качестве альтернативы зафиксируйте железу в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем промойте ткань в 70% ethanol в течение 15 минут.

Затем постепенно регидратируйте образец в воде, удаляя половину раствора этанола из флакона и заменяя ее дважды дистиллированной водой. Инкубируйте в течение пяти минут. Повторите процедуру три раза, затем промывайте дистиллированной водой в течение пяти минут.

Затем окрасьте железу в растворе угольно-алюминиевых квасцов в течение ночи при комнатной температуре; на следующий день удалите краситель для повторного использования и постепенно обезводьте окрашенную ткань, используя серию ванн с этанолом по пять минут каждая. Затем промойте ткань в ксилоле в течение ночи; после просветления погрузите молочную железу в метилсалицилат, удерживая его в вытяжном шкафу до момента получения изображений. Степень развития молочной железы можно количественно оценить путем подсчета количества разветвлений или боковых ветвей вдоль участков протоков; также может быть оценена длина первичных протоков или соотношение площади эпителиальной и жировой тканей.

Второй метод, используемый для оценки развития и функции молочных желез, предполагает воздействие на железу окситоцином и оценку выведения молока в эпителиальные протоки. Для проведения этого анализа недавно родившихся детенышей следует отнять от груди матери, а мать содержать в изоляции в течение одного часа. Затем усыпите мать и обнажите молочные железы, как описано в разделе по диссекции молочных желез.

Однако оставьте их в организме животного. Начните анализ, используя переносную пипетку, чтобы равномерно нанести от трех до пяти миллилитров PBS или раствора окситоцина непосредственно на интересующую молочную железу. Для этой процедуры рекомендуется использовать грудные железы, используя одну сторону в качестве контроля, а другую — для тестирования эжекции молока.

Инкубируйте железы в течение одной минуты и удалите растворы, осторожно аспирировав их трансфер-пипеткой; контролируйте поступление молока в протоки с помощью видеозаписи или путем получения изображений до и после воздействия PBS или окситоцина. Ниже представлены примеры из архива по мышам. Эпителий протоков желез, отмеченный стрелками, и лимфатический узел, отмеченный наконечником стрелки, легко наблюдаются при правильном распластывании всей молочной железы.

Плохо распластанная молочная железа может отслоиться от предметного стекла и сморщиться, что сделает её непригодной для использования. Неправильно иссеченная молочная железа может иметь либо отсутствующие части, либо остатки мышечной ткани или кожи. Эжекция молока, индуцированная окситоцином, может наблюдаться в эпителии уток после воздействия окситоцина.

Однако, если протоки уже заполнены молоком в начале анализа из-за неоправданно длительного периода латентности после последнего выкармливания щенков, дальнейшее накопление молока в протоках после воздействия окситоцина трудно наблюдать. С другой стороны, слишком короткий период латентности после выкармливания щенков предотвратит накопление в альвеолах достаточного количества молока для его надлежащего обнаружения в протоках после воздействия окситоцина и последующего препарирования молочных желез. Вместо установки препарата или оценки индуцированного окситоцином выведения молока, молочные железы можно заморозить, изготовить криосрезы и провести иммуномаркирование любого количества резидентных белков молочных желез.

Как вариант, железы можно подвергнуть лизису и подготовить к вестерн-блоттингу. Совокупность этих двух методов анализа позволила ответить на фундаментальные вопросы, касающиеся развития, дифференцировки и функции желез, на любом количестве моделей мышей, созданных с делецией ключевых генов или с мутациями в соответствующих генах.