Секвенирование бактериальной микрофлоры в периферической крови: Наш опыт работы с ВИЧ-инфицированных пациентов

Секвенирование бактериальной микрофлоры, транслоцируемой в периферическую кровь. Наш опыт работы с пациентами, инфицированными ВИЧ. Я, младший Марти, работаю адъюнкт-профессором в Клинике инфекционных заболеваний и тропической медицины Миланского университета в Италии. Сейчас мы продемонстрируем вам эксперименты по выявлению и секвенированию бактериальной ДНК из периферической крови пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Здоровый желудочно-кишечный тракт колонизирован огромным разнообразием комменсальных микробов, которые влияют на развитие гуморальной и клеточной систем иммунитета слизистых оболочек. Микробиота отделена от иммунной системы прочным слизистым барьером; однако при ряде клинических состояний, таких как инфекции, антибиотикотерапия, послеоперационные осложнения, а также у пациентов с карциномой, панкреатитом и мальнутрицией, этот барьер нарушается. В результате происходит изменение состава и структуры желудочно-кишечного тракта.

ВИЧ-инфекция вызывает нарушение целостности желудочно-кишечного барьера с прогрессирующим сбоем слизистого иммунитета и утечкой биопродуктов бактерий, таких как липополисахарид и фрагменты бактериальной ДНК, в системный кровоток, что способствует системной иммунной активации; в данном видео будут продемонстрированы экспериментальные этапы обнаружения и секвенирования бактериальной ДНК. В исследовании образцов периферической крови пациентов с ВИЧ-инфекцией принимают участие Camilla ti, клинический резидент по инфекционным болезням, Esther, аспирантка, и ju MariaI, постдокторант; все они работают в клинике инфекционных и тропических болезней Миланского университета. Целью нашего эксперимента является идентификация видов бактерий в образцах периферической крови пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Мы будем использовать цельную кровь как ВИЧ-инфицированных, так и здоровых субъектов, поскольку у здоровых людей наблюдается нормальный кишечный гомеостаз. Мы не ожидаем обнаружить транслокацию микрофлоры у этих пациентов. Будет произведен забор цельной крови у пациентов с последующим выделением плазмы.

Затем будет проведена экстракция ДНК для выполнения ПЦР с широким спектром праймеров для анализа 16 s рибосомального гена PCIC. После получения ПЦР-продукта будут выполнены очистка, клонирование и секвенирование. Первым этапом нашего эксперимента является забор крови путем венепункции с последующим выделением плазмы.

Приблизительно 9 мл цельной крови забирают в пробирки с ЭДТА. Пробирки помещают в центрифугу при 2000 об/мин на 10 минут. Центрифугирование при комнатной температуре обеспечивает отделение плазмы.

Теперь приступим к экстракции ДНК из образцов плазмы. Чтобы гарантировать стерильность, надлежащим образом продезинфицируйте вытяжной шкаф, дозаторы и материалы, необходимые для эксперимента: поместите все материалы под УФ-лампы минимум на 30 минут. Выключите УФ-лампы, протрите перчатки дезинфицирующим средством, смочите несколько бумажных полотенец этанолом и положите их в вытяжной шкаф, чтобы использовать их при каждом сбросе наконечника. В процессе экстракции ДНК протирайте дозатор влажными бумажными полотенцами.

Теперь вы можете приступить к экстракции ДНК. Экстракция ДНК проводится с использованием коммерческого набора согласно инструкциям производителя. Вкратце: 350 µL плазмы переносят в пробирку типа «эппендорф» объемом 2 мл.

В качестве отрицательного контроля используется ультрачистая вода. К образцам добавляют 10 µL лизосом до конечной концентрации 1 mg/mL. Затем образцы инкубируют в течение 30 минут.

После центрифугирования к образцам при 37 °C согласно инструкции добавляют раствор А, хлороформ и раствор B. В результате образуются три отчетливые фазы. Супернатант собирают и добавляют в осадительный этанол для преципитации ДНК, после чего концентрацию ДНК определяют с помощью спектрофотометра.

Следующим этапом является проведение ПЦР с широким спектром праймеров для амплификации 16S рибосомального гена; ПЦР проводится в специализированном помещении. ПЦР-смесь готовится с использованием указанных реагентов. ПЦР-смесь центрифугируют в течение 30 минут при 500 ×g и температуре 4 °C, чтобы избежать возможного загрязнения бактериальной Taq-полимеразой.

Затем ПЦР-смесь разделяют на аликвоты в соответствии с количеством образцов, требующих амплификации. Не забудьте предусмотреть аликвоты для отрицательного и положительного контролей реакции.

ТЕРМОЦИКЛИРОВАНИЕ программируют в следующих условиях: 94 °C в течение пяти минут; далее 40 циклов: 94 °C, 55 °C и 72 °C по одной минуте; затем 72 °C в течение 10 минут. Средняя продолжительность составляет три часа.

Продукты ПЦР визуализируют в 2% AGROS-геле. На данном 2% AGROS-геле представлены продукты ПЦР. В первой дорожке находится маркер молекулярной массы с шагом в 100 пар оснований.

Вторая дорожка — положительный контроль ПЦР. Третья дорожка содержит отрицательный контроль ПЦР. На четвертой дорожке представлены образцы пациента с ВИЧ-положительным статусом, а пятая дорожка представляет собой дорожку с водой.

На шестой дорожке представлены образцы здорового человека и отрицательная ПЦР-реакция. На седьмой дорожке находится вода. Следующим этапом является ПЦР-верификация.

Продукты ПЦР очищают с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя. На этом этапе используется множество колонок с фильтрами. Результаты ПЦР заносят в рабочий лист.

Теперь мы перейдем к клонированию с использованием сине-белого скрининга — молекулярного метода, который позволяет определить успешную лигацию ДНК в вектор. Вектор трансформируют в компетентные бактериальные клетки.

Компетентные клетки выращивают в присутствии xal. При успешной лигации бактериальная колония будет белого цвета. В противном случае колония будет синей.

X-gal используется для определения того, экспрессирует ли клетка фермент бета-галактозидазу, и для визуализации трансформации колоний e coli; IPTG индуцирует экспрессию бета-галактозидазы. X-gal и IPTG наносят круговыми движениями на чашки с агаром, содержащим ампициллин. Клонирующая смесь, состоящая из продуктов ПЦР, SALT и вектора для клонирования, готовится в соответствии с инструкциями производителя.

Клетки E coli выдерживают на льду. Затем к клеткам добавляют смесь для клонирования, после чего проводят тепловой шок и высевают клетки на чашки, которые инкубируют в течение ночи при 37 °C. После инкубации на чашках развиваются белые и синие колонии.

Белые колонии являются положительными по продуктам ПЦР. Вставки и синие колонии являются отрицательными по вставке продукта ПЦР. Отобраны 10 белых колоний и одна синяя колония.

Каждую колонию переносят в 2 мл жидкой среды LB. Колонии инкубируют в среде с добавлением ампициллина в течение ночи при 37 °C. После инкубации колонии, выращенные за ночь, используют для экстракции плазмид с помощью коммерческого набора для мини-препа.

Для данного этапа используются мини-колонки с фильтрами. После экстракции плазмиды визуализируют на 0,7% AROS-геле. На данном 0,7% AROS-геле представлены продукты мини-препарации. В первой дорожке находится маркер молекулярной массы 1 kb.

Во второй лунке находится контрольная колония синего цвета. В лунках с третьей по двенадцатую находятся белые колонии. Результаты записываются в рабочий лист; следующим этапом следует секвенирование, после чего проводится амплификация плазмид.

Из указанных реагентов готовят смесь. Реакционную смесь для ПЦР разделяют на аликвоты в соответствии с количеством образцов, подлежащих амплификации. Программу термоциклирования устанавливают следующим образом: 96 °C в течение одной минуты, 96 °C в течение 10 секунд, 50 °C в течение пяти секунд, 60 °C в течение четырех минут.

Провести 25 циклов. Средняя продолжительность составляет примерно один час. После амплификации продукты ПЦР очищают с помощью колонок с фильтрами.

Очищенные продукты наносятся на планшет, который затем помещают в секвенатор. После получения последовательности ее анализируют с помощью BLAST для идентификации бактериальных видов в каждой колонии. Колонии, демонстрирующие гомологию последовательностей от 98% до 100%, считаются положительными.

Это пример бактериального секвенирования плазмы крови одного ВИЧ-положительного пациента. Наши результаты показывают, что микробная транслокация при ВИЧ-инфекции связана с полимикробной флорой. Настоящим мы продемонстрировали, что у пациентов с ВИЧ-инфекцией в системном кровотоке наблюдается выраженная полимикробная микрофлора.

ДНК бактерий в периферической крови у наших здоровых лиц, отрицательных по ВИЧ, находилась ниже предела обнаружения, что, возможно, отражает целостность желудочно-кишечного тракта. В настоящее время наше исследование сосредоточено на понимании и изучении возможной роли микрофлоры в периферической крови в формировании иммунопатогенеза ВИЧ и, возможно, в ответе на терапию.