Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

Общая цель этой процедуры заключается в преобразовании дрожжевых клеток с помощью массива плазменных ДНК. Это достигается путем выращивания соответствующего количества дрожжевых клеток. Затем дрожжевые клетки обрабатываются ацетатом лития, чтобы сделать их пригодными для трансформации ДНК.

Затем трансформируйте компетентные клетки Е, смешав их с ДНК. Заключительным этапом процедуры является выбор и анализ трансформаторов. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие влияние плазменной ДНК на фенотипы дрожжей с помощью анализов на дрожжевые пятна и/или микроскопии.

Основное преимущество этого метода перед существующими протоколами, такими как стандартные дрожжевые трансформации, заключается в том, что он позволяет автоматически трансформировать большое количество различных плазмид в дрожжевые клетки. Этот протокол высокопроизводительного преобразования дрожжей рассчитан на 10 96-луночных планшетов, но может быть увеличен или уменьшен соответственно. При проведении крупномасштабных экспериментов ключом к успеху является поддержание порядка на всех планшетах и реагентах.

Как только эксперимент начнется, чтобы избежать путаницы, в этом протоколе будет использоваться биобот-манипулятор для быстрой жидкости Чтобы начать аликвоту, от пяти до 10 микролитров плазменной ДНК плазмы из массивной библиотеки дрожжевых плазмид в каждую лунку раунда. Дно 96 луночных пластин. Поместите 96 луночных пластин без крышки в чистый настольный вытяжной шкаф на ночь для просушки.

Затем инокулируйте 200 миллилитров дрожжевого пептида декстрозы или среды YPD с запрашиваемым штаммом в колбу Линь Мейера объемом 500 миллилитров, инкубируйте в течение ночи при 30 градусах Цельсия с встряхиванием на следующее утро. Разбавьте запрашиваемую деформацию до наружного диаметра 600 0,1 в двух литрах среды YPD для оптимального роста. Выращивают до одного литра культур в отдельных 2,8 литровых колбах с перегородками.

Встряхивайте колбы в течение четырех-шести часов при температуре 30 градусов Цельсия, пока культуры не достигнут наружного диаметра 600 от 0,8 до 1,0. Когда дрожжевая культура достигнет наружного диаметра 600 от 0,8 до 1,0, соберите клетки методом центрифугирования. Заполните четыре одноразовые конические пробирки объемом 225 миллилитров культурой и вращайте со скоростью 3000 об/мин в течение пяти минут в настольной центрифуге.

Слейте надосадочную жидкость S из каждой трубки. Добавьте больше культуры в те же пробирки и снова центрифугируйте, повторяя по мере необходимости, пока не будут собраны все клетки. Промойте каждую ячейку гранулы в 50 миллилитрах автоклавной дистиллированной воды и проведите резус путем вортексирования.

Соедините ячейки в одной конической трубке объемом двести двадцать пять миллилитров и вращайте со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости промойте клетки в ста миллилитрах раствора ацетата лития. Вращайте снова со скоростью 3000 об/мин в течение пяти минут.

Извлеките СНС и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 70 миллилитрах раствора ацетата лития. Вихрь на высокой скорости около 30 секунд до полного ресуспендирования пеллеты. Выдерживать при встряхивании при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Далее добавьте бета ме капто этанол в 0,1 моляра, инкубируйте с встряхиванием при 30 градусах Цельсия еще 30 минут. После 30-минутной инкубации добавьте в клеточную смесь два миллилитра вареной и охлажденной ДНК спермы лосося. Вылейте смесь ячеек в автоклавируемую однолуночную пластину, а затем удалите образующийся осадок, поскольку он может помешать пипетированию на последующих этапах.

С помощью биоробота Rapid Plate аликвотируют 50 микролитров клеточной смеси в каждую лунку из четырех ранее приготовленных. 96 лунок планшеты, содержащие плазму ДНК, не смешивают. Инкубируйте планшеты при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания во время инкубации клеток.

Приготовьте 200 миллилитров раствора ацетата лития PEG DMSO. Соедините 160 миллилитров 50% PEG 33, 50 20 миллилитров ДМСО и 20 миллилитров одного моляра ацетата лития. Важно, чтобы этот раствор был приготовлен непосредственно перед применением.

Добавьте в каждый по 125 микролитров раствора ДМСО ацетата лития ПЭГ. Хорошо перемешать, аспирируя и дозируя клеточную суспензию восемь раз. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут без встряхивания.

Затем подвергните ячейки тепловому шоку при температуре 42 градуса Цельсия в течение 15 минут В сухом инкубаторе не складывайте пластины после теплового удара, вращайте пластины с помощью адаптеров центрифуги, чтобы вместить 96 луночных планшетов. После центрифугирования удалите раствор ПЭГ, перевернув пластины над ведром для отходов. Затем промокните перевернутые тарелки на бумажных полотенцах.

Для удаления остатков жидкости ячейки останутся на дне лунок. Промойте ячейки, добавив в каждую по 200 микролитров минимального количества среды. Ну и закрутите пластины еще раз.

Удалите надосадочную жидкость, перевернув ее над ведром для мусора и промокнув бумажными полотенцами. Добавьте по 200 микролитров минимальной среды в каждую лунку с помощью быстрой тарелки, инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух суток без встряхивания. Через двое суток на дне каждой успешно трансформировавшейся должны начать формироваться небольшие колонии клеток.

Чтобы подготовиться к анализу Спатинга, сначала нанесите 200 микролитров минимального количества среды на основе OSE в каждую лунку нового помещения. Дно 96 луночной пластины. Следующий. Перемешайте каждую лунку трансформационной пластины, аспирируя и дозируя клеточную суспензию восемь раз с помощью быстрой пластины.

Инокулируйте каждую лунку рафинозной пластины пятью микролитрами клеточной смеси из трансформационной пластины, инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение одного дня. На следующий день. На дне каждого должны присутствовать небольшие колонии.

Хорошо проведите тест на пятнистость в капюшоне, простерилизуйте 96 болт, репликатор или лягушку методом пламени. Смешайте колонии с помощью лягушки, а затем нанесите колонии на тарелки с селективной средой. После пятнистости дайте пластинам высохнуть в вытяжке в течение пяти-10 минут.

Выдерживайте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех дней. Здесь представлены репрезентативные результаты скрининга плазмиды дрожжей на экспрессию для выявления супрессоров и усилителей TDP 43.Токсичность. TDP 43 — это человеческий белок, который участвует в патогенезе миотрофического бокового склероза или болезни Лу Герига. Экспрессия TDP 43 в дрожжевых клетках приводит к агрегации и цитотоксичности.

Эти пластины отображают колонии с интегрированной галактозоиндуцируемой плазмидой T DP 43, которые также были преобразованы плазмидами из библиотеки экспрессии ORF гена flex. Колонии здесь имеют красный цвет, потому что штамм имеет мутацию, которая приводит к накоплению красного пигмента. Пластина слева содержит глюкозу, которая подавляет экспрессию T DP 43 или плазмид гена flex

Пластинка справа содержит галактозу, которая индуцирует экспрессию TDP 43 и O Fs в плазмидах гена flex. Зеленая стрелка указывает на колонию, преобразованную с помощью плазмиды, которая подавляет токсичность TDP 43, на что указывает более быстрый рост и более плотные колонии. Красная стрелка указывает на колонию, преобразованную с помощью плазмиды, которая усиливает токсичность TDP 43, на что указывает более медленный рост и менее плотные колонии.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как трансформировать и избежать библиотеки плазменных ДНК клеток.