Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Целью данного эксперимента является характеристика состава и фенотипа аортальных и адвентиционных инфильтрирующих лейкоцитов с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем выделения атеросклеротической аорты в качестве второго этапа. Окружающая адвентиция изолируется от аорты и из обеих тканей получают одноклеточные суспензии.

Затем были получены одноклеточные суспензии флуоресцентно меченных для дифференциации специфических подмножеств лейкоцитов из адвентной ткани и результатов аортальной стенки, которые демонстрируют разнообразие аортальных инфильтрирующих лейкоцитов во время атерогенеза и возможность выделения аортальных адвентных тканевых лейкоцитов на основе проточного цитометрического анализа одиночных клеточных суспензий. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как иммуногистохимия, заключается в том, что лейкоциты могут быть исследованы и фенотипированы с использованием нескольких маркеров из одной аорты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся клеточных медиаторов воспаления в патогенезе атеросклероза и других сосудистых воспалительных заболеваний.

Выявление лейкоцитов аорты и фенотипическая характеристика существующих и новых медиаторов воспаления помогут разобраться в механизмах атеросклероза. Положите на лед пустую пробирку для сбора крови и пробирку для сбора крови с PBS. Для сбора каждой аорты кратковременно замочите усыпленную мышь с 70% этанолом и прикрепите мышь к этапу вскрытия с помощью лабораторной ленты.

Затем с помощью гепаринизированного шприца возьмите кровь у мыши с помощью пункции сердца. Вскрыть брюшную и грудную полости с помощью препарных препарных ножниц с помощью шприца объемом 10 миллилитров с иглой 25 калибра, полностью перфузировать сосудистую сеть PBS, содержащей 2% гепарина. Далее препарируйте и удалите висцеральные органы, половые органы мочеполовой системы, диафрагму и селезенку, оставив сердце и аорту почки нетронутыми.

Убедитесь, что в тканях аорты нет крови. Тщательно рассеките жировые ткани и парааортальные лимфатические узлы в сторону от аорты, оставив аорту и адвентицию нетронутыми. Затем собирают всю аорту, включая дугу аорты и нисходящую, нисходящую грудную и брюшную части.

Поместите изолированную аорту в сборную пробирку с PBS. Извлеките PBS из сборной трубки, содержащей аорту. Добавьте в аорту 2,5 миллилитра одноразового раствора аортального адвентиции фермента пищеварения.

Затем инкубируйте аорту с раствором фермента в течение 10-20 минут. При 37 градусах по Цельсию. Добавьте PBS в чашку Петри во время инкубации.

После инкубации. Переносите частично переваренную аорту из ферментного раствора в чашку Петри с помощью PBS очень осторожно. С помощью двух пар изогнутых щипцов отклейте слой ткани Адвента от аорты как единое целое.

Когда адвентиция будет полностью удалена, перенесите адвентицию и аорту в отдельные факсимильные трубки. Затем добавьте 2,5 миллилитра одноразового раствора фермента диссоциации аорты в аорту и адвентицию. Аорту можно разрезать на более мелкие кусочки.

Чтобы облегчить ферментативное пищеварение, инкубируйте аорту и адвентицию еще 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После этой инкубации поместите аорту и адвент-тканевые трубки на лед. Приготовьте суспензию одиночных клеток из аорты и адвентиции с помощью клеточных фильтров 70 микрон и поршней шприца, чтобы разрезать оставшуюся ткань.

Перенесите клеточные суспензии в пятимиллилитровые полипропиленовые трубки для факса. Гранулируйте клетки центрифугированием в течение пяти минут при 400-кратной гравитации при четырех градусах Цельсия. Риз согнул клетки в одном миллилитре факс-буфера и использовал триановый синий и гемоцитометр для подсчета клеток.

Так как обработка ферментами может повлиять на экспрессию поверхностных антигенов. Инкубируйте небольшие кусочки селезенки с ферментным коктейлем или без него в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия через один час. Подтвердить отсутствие влияния на экспериментальную поверхностную экспрессию антигена методом проточной цитометрии.

Промаркируйте соответствующее количество новых экспериментальных и контрольных факсимильных трубок. Добавьте экспериментальный и контрольный коктейли антител к желаемым внеклеточным антигенам в отдельный набор меченых пробирок. Поместите трубочки для коктейля на лед и накройте их, чтобы защитить флуорофоры от света.

Затем перенесите аликвоту от пяти до восьми умножить на 10 на пять клеток аорты и адвентиса в соответствующие предварительно помеченные факсимильные трубки. Добавьте один миллилитр буфера для факса в каждую пробирку и гранулируйте клетки центрифугированием. Удалите супан натант из гранулированных клеток путем сцеживания, чтобы отличить живые клетки от мертвых.

Сначала можно использовать набор для окрашивания мертвых, исправимых мертвых клеток, создать раствор для однократных живых мертвецов, добавив один микролитр растворенного красителя для живых мертвецов в один миллилитр PBS и вортекс для смешивания. Далее добавьте от 100 до 200 микролитров одноразового живого мертвого красителя в пробирки с экспериментальным и контрольным образцом. Затем инкубируйте образцы при диетической комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.

Инкубируйте единственную контрольную трубку для живых мертвецов при температуре 56 градусов Цельсия в темноте в течение 10 минут, чтобы убить клетки тепловым шоком. После инкубации промойте все клетки одним миллилитром PBS и гранулируйте клетки центрифугированием. Затем промойте ячейки, добавив по одному миллилитру буфера для факса в каждую трубку.

Вортексирование пробирок для их смешивания, а затем гранулирование ячеек методом центрифугирования. Удалите супинат из ячеек путем декантации. Добавьте 100 микролитров блокина FC.

Отправьте факс в буфер ко всем трубкам и аккуратно закрутите трубки, чтобы снова суспендировать клетки. Инкубируйте образцы в течение 10-15 минут при комнатной температуре в темноте. Далее промойте ячейки, как и раньше.

Удалите SUP natum из клеток путем декантации. Добавьте 100 микролитров соответствующего коктейля антител в соответствующие его пробирки. Аккуратно переведите вихрь в ресус.

Суспензируйте гранулу и инкубируйте все пробирки в течение 20-30 минут при комнатной температуре в темноте после 20-30-минутного внеклеточного окрашивания. Промойте клетки дважды, как и раньше, сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в 300 микролитрах 2% параформальдегида. TER one 19 демонстрирует, что переваренные сосуды, не циркулирующие в периферической крови, являются источником большинства анализируемых лейкоцитов в суспензии клеток аорты.

TER 1 1 9 положительные эритроциты составляют 18% клеток в этой представительной суспензии клеток аорты. Это указывает на то, что было оценено менее 0,02% клеток, выделенных из суспензий клеток аорты, полученных от воздействия ферментного коктейля диссоциации аорты на поверхностные антигены цитов. Ферментный коктейль не оказывает влияния на экспрессию CD 45 или CD 19, как показано здесь, а также CD 3 TCR, альфа бета TCR Gamma delta и некоторых других поверхностных антигенов, не показанных на этом рисунке.

На следующих нескольких рисунках живые аортальные CD 45 положительные лейкоциты были скобированы для определения процентного соотношения интерферона гамма-положительных Т-клеток в бассейне аорты двух молодых мышей с дефицитом липопротеина е APO. Здесь показано, что передний и внутренний профили рассеяния репрезентативной аорты APOE для анализа лейкоцитов использовался только общий лейкоцитарный антиген CD 45, как показано здесь. Небольшая зернистая популяция вдоль боковой оси рассеяния в прямом и боковом профиле разброса лейкоцитов аорты, показанная на этом рисунке, предполагает, что некротические клетки присутствуют в нашей лейкоцитарной походке для удаления этих клеток.

Наличие небольших негранулярных клеток в положительном профиле прямого и бокового рассеяния CD 45 позволяет предположить, что фрагменты клеток все еще присутствуют в положительном профиле отрицательной походки CD 45. Был нарисован многоугольный затвор разброса на передней стороне, чтобы включить в анализ только более крупные жизнеспособные клетки, как показано здесь. Изучение популяции CD 45 положительного живого мертвеца отрицательного прямого бокового рассеяния для TCR альфа бета и интерферона гамма показывает, что 6% живых лейкоцитов аорты являются TCR альфа бета положительным интерфероном гамма положительным Т-хелпером клетками с использованием аналогичной схемы стробирования, что и в предыдущей серии рисунков, репрезентативных данных внутриклеточного окрашивания для CD 68 положительных CD 11 B положительных макрофагов и интерферона гамма положительного TCR альфа бета положительных клеток из Две мыши, которых кормили западной диетой в течение 12 недель, можно увидеть на следующих рисунках, как и ожидалось, как видно на этом рисунке.

Аорту западной диеты кормили мышью APOE null. Большинство лейкоцитов в аорте являются макрофагами с двойной положительностью 40% CD 68 и CD 11 B. Другие CD 11 B положительные миелоидные клетки составляют 15% аортального лейкоцита, заселенного в селезенке той же западной диеты, которую кормили мышью APOE null

7% жизнеспособных SP-цитов были CD 11 B положительными CD 68 положительными макрофагами, а 10% были другими CD 11 B положительными миелоидными клетками. Напротив, на этом рисунке репрезентативного контрольного образца с аналогичным окрашиванием изотипа только 0,01% жизнеспособных нуль-цитов APOE являются ложноположительными по изотипу. Кроме того, в течение 12 недель в западной диете мышей с нулевыми клетками APOE, TCR альфа, бета-положительный интерферон гамма-отрицательные Т-хелперы и интерферон гамма-продуцирующие TH-клетки составляют основную часть популяций аортальных инфильтрирующих и селезеночных резидентных Т-клеток.

Как видно на этом рисунке, исследование aov, ни один цит, окрашенный контролем изотипа, позволяет предположить, что только 0,5% альфа-бета-положительных интерферон-положительных клеток TCR являются ложноположительными на интерферон гамма. Чтобы продемонстрировать возможность выделения адвентиции аорты для окрашивания проточной цитометрией, показано репрезентативное окрашивание CD 45-положительных лейкоцитов для суспензии клеток аорты и адвента. Инфильтрирующие CD 45-положительные лейкоциты составляли примерно 18% суспензии адвентициальных клеток и 11% суспензии клеток аорты. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что эти реагенты и клетки должны храниться на льду и в темноте, если не указано иное.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выделять и готовить одиночные клеточные суспензии из аорты и адвентиции аорты или использовать в экспериментах по проточной цитометрии.