Микроинъекция мыши ооцитов, созревание и Плоидность Оценка
23 июля 2011 г.
Ооциты склонны к анеуплоидии из-за ошибок в сегрегации хромосом во время мейоза созревания. Анеуплоидных яйца могут стать причиной бесплодия, выкидышей или отклонениями в развитии, как синдром Дауна. Здесь мы опишем методы представить материалы по выбору в ооциты и методы для изучения мейоза созревания и оценки плоидности.
Общая цель данной процедуры заключается в оценке метафазы II яйцеклеток. После экспериментального воздействия начните со сбора полностью выросших ооцитов мыши у подготовленных половозрелых самок. Затем проведите микроинъекцию в ооциты выбранных материалов для воздействия на интересующий белок и доведите ооциты до созревания in vitro до метафазы II мейоза. Далее стимулируйте распластывание хромосом в яйцеклетке путем обработки мантрозолом, что приведет к формированию монополярного веретена деления.
В конечном итоге, эти результаты позволяют определить плоидность яйцеклетки с помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репродуктивной биологии и сегрегации хромосом, например, в понимании молекулярных механизмов, приводящих к анеуплоидии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как технику микроинъекций трудно освоить, поскольку несколько этапов сложно описать письменно. Введите внутрибрюшинно половозрелым самкам мышей 5 IU беременного гонадотропина сыворотки лошади, чтобы максимизировать количество антральных фолликулов, выделяемых из каждой мыши.
Примерно через 48 часов после прайминга PMSG согрейте по 3 мл среды для сбора на мышь при 37 °C и выдержите. Один миллилитр культуральной среды в течение как минимум одного часа. Подготовьте микрокапли каждой среды в чашке Петри и залейте их минеральным маслом.
Теперь поместите чашку с культуральной средой в инкубатор, а чашку со средой для сбора на подогреватель предметных стекол. Пожертвуйте мышь, выделите яичники и поместите их в часовое стекло, содержащее предварительно подогретую среду для сбора.
С помощью инсулинового шприца объемом 1 мл зафиксируйте яичники на чашке и высвободите антральные фолликулы, несколько раз прокалывая их скрепленными вместе иглами 27-го калибра. Под диссекционным микроскопом соберите кумулюсно-ооцитарные комплексы, используя стеклянную пипетку с ручным управлением. Собирайте только крупные антральные фолликулы, не затрагивая более мелкие преантральные фолликулы или денудированные ооциты.
Перенесите комплексы в микрокаплю подготовленной среды для сбора с помощью пипетки, диаметр которой немного превышает диаметр ооцита. Отделите кумулюсные клетки от комплексов. Перенесите денудированные ооциты с помощью пипетки большего размера в микрокаплю культуральной среды.
Перед началом манипуляций дайте ооцитам восстановиться в инкубаторе в течение как минимум одного часа. Изготовьте инъекционные пипетки, вытянув боросиликатные стеклянные капиллярные трубки с помощью механического пуллера. Извлеките камеру с питательной средой из однолуночного предметного стекла с камерой.
Для создания платформы для микроинъекций поместите каплю собирающей среды объемом 5 µL как можно ближе к капле материала для инъекции siRNA, NAC RNA или морфолино-олигонуклеотида объемом 0,5 µL, закройте минеральным маслом и поместите на предметный столик микроскопа. Установите инъекционную и удерживающую пипетки в держатели и расположите их в капле собирающей среды. Откройте баллоны с азотом, которые подключены к пикоинжектору и антивибрационному столу.
Откройте кончик инъекционной пипетки, осторожно постучав ею по удерживающей пипетке во время заполнения её средой. Перенесите от пяти до 10 ооцитов из инкубатора в каплю собирающей среды на платформе. Теперь установите параметры пикоинжектора на объем инъекции от пяти до 10 picoliters, нажав кнопку clear.
Переместите инъекционную иглу в каплю с материалом и заполните её. Верните иглу в каплю со средой. Используя удерживающую пипетку, захватите ооцит и совместите инъекционную иглу, ооцит и удерживающую пипетку вдоль оси x.
При большем увеличении проведите инъекционную пипетку сквозь ооцит, стараясь не задеть ядро. После прокола плазматической мембраны нажмите кнопку «inject» (инъекция), затем извлеките иглу, отпустите ооцит и повторите процедуру. После завершения инъекций во всех ооцитах верните их в инкубатор в культуральную среду на необходимый период времени, который обычно составляет от 12 до 24 часов.
Затем промойте циты несколькими каплями CZB, перенесите их в микрокаплю CZB под маслом и инкубируйте в течение 16 часов до завершения созревания до метафазы второго мейоза. Поместите 750 µL CZB, содержащего 100 µM Mastri, в лунку чашки для органокультивирования, в внешнем кольце которой находится вода. Теперь промойте яйцеклетки несколькими каплями CZB с добавлением mastri, затем перенесите их в чашку для органокультивирования и инкубируйте в течение одного часа.
Зафиксируйте яйца в чашке Петри с 2% параформальдегидом в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем перенесите яйца в блокирующий раствор и храните при температуре четырех градусов Цельсия до момента пермеабилизации яиц в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого промойте их несколькими большими объемами блокирующего раствора.
Оставшуюся часть процедуры проводят на крышке 96-луночного планшета, помещенного во влажную камеру и защищенного от света. При комнатной температуре перенесите яйцеклетки в капли блокирующего раствора объемом 25 microliter на 15 минут. Затем, для маркировки центромер, перенесите яйцеклетки в каплю блокирующего раствора, содержащего антисыворотку Crest в разведении 1:40, и инкубируйте не менее одного часа.
Затем промойте образец, последовательно используя три капли блокирующего раствора, инкубируя по 15 минут в каждой. Перенесите яйца в каплю блокирующего раствора, содержащую конъюгированное антитело с флуорофором 4, и инкубируйте в течение одного часа. Промойте дважды и добавьте блокирующий раствор для визуализации хромосом.
Инкубируйте в разведении от 1:1 до 1:5 000 cytx green и блокирующем растворе, затем зафиксируйте образцы в 5 µL Vector Shield. Нанесите четыре небольших пятна вазелина в местах предполагаемого расположения углов покровного стекла, чтобы предотвратить раздавливание яиц. Накройте покровным стеклом, загерметизируйте лаком для ногтей и храните в кассете для предметных стекол при 4 °C до проведения конфокальной микроскопии. При съемке с использованием объектива 100x делайте шаги 0,4 µm в плоскости Z и снимайте всю область метафазы; подсчет центромер выполняйте с помощью программного обеспечения для анализа изображений, такого как ImageJ от NIH. Эуплоидные яйца мыши содержат 20 пар кинетохоров, что дает в общей сложности 40 точек на данной Z-проекции эуплоидной метафазы II; ДНК окрашена в зеленый цвет, а кинетохоры — в красный.
Стрелки указывают на два отдельных плеча хроматид, что свидетельствует о перекрытии в области кинетохора номер 17 и номер 18 после процедуры микроинъекции. Другие методы, такие как вестерн-блоттинг, ПЦР в реальном времени, оценка конфигурации веретена деления и выравнивания хромосом, а также экстракорпоральное оплодотворение, могут быть использованы для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, как нарушение функции интересующего вас белка влияет на миотическое созревание и потенциал развития. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как манипулировать аллелями и оценивать PLO в метафазе II.
Обзор
В данной статье рассматриваются методы введения материалов в ооциты и изучения мейотического созревания для оценки плоидности. Ооциты подвержены анеуплоидии, которая может привести к бесплодию и нарушениям развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Репродуктивная биология
- Сегрегация хромосом
- Мейоз
Теоретические основы
- Анеуплоидия в ооцитах может быть результатом ошибок во время мейотического созревания.
- Бесплодие и выкидыши могут быть следствием анеуплоидии яйцеклеток.
- Понимание плоидности имеет решающее значение для репродуктивного здоровья.
- Для демонстрации сложных методов микроинъекций необходимы визуальные средства.
Цель исследования
- Для оценки плоидности яйцеклеток в метафазе II.
- Для введения специфических материалов в ооциты с целью экспериментальных манипуляций.
- Для изучения молекулярных механизмов сегрегации хромосом.
Используемые методы
- Микроинъекция ооцитов интересующими материалами.
- Созревание ооцитов in vitro до метафазы II.
- Методы распластывания хромосом и иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Конфокальная микроскопия для визуализации и анализа.
Основные результаты
- Были успешно проведены микроинъекция и дозревание ооцитов.
- Метод иммунофлуоресценции позволил определить плоидность яйцеклеток.
- Визуальная демонстрация методов подчеркнула сложность процесса микроинъекции.
- Полученные результаты способствуют пониманию репродуктивной биологии и динамики хромосом.
Выводы
- Описанные методы эффективны для изучения плоидности ооцитов.
- Полученные данные могут быть использованы при разработке стратегий охраны репродуктивного здоровья.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения задействованных молекулярных механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Оценка плоидности ооцитов имеет решающее значение для понимания механизмов сегрегации хромосом, которые влияют на репродуктивное здоровье и результаты развития. Данный метод позволяет проводить прямую оценку анеуплоидии в женских гаметах, предоставляя физиологически релевантную систему для валидации мишеней в исследованиях фертильности. Благодаря сочетанию микроинъекций с оценкой плоидности целых яйцеклеток, этот подход способствует механистическому снижению рисков при изучении генов, участвующих в мейозе I и II, что служит основой для доклинических моделей бесплодия и нарушений развития.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию генов в процессах мейоза и сегрегации хромосом с помощью микроинъекций мРНК или морфолино.
- Практическая ценность: обеспечивает использование системы ооцитов с подавленной транскрипцией, где эктопическая экспрессия требует введения мРНК, что гарантирует контролируемую временную модуляцию белков.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: использование монополярных веретен деления, индуцированных монастролом, и иммунофлуоресценции CREST для количественного подсчета кинетохоров и выявления гипо- и гиперплоидии в интактных яйцеклетках.
- Практическая ценность: предотвращение потери хромосом, характерной для методов распластывания, что повышает воспроизводимость и точность оценки плоидности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает молекулярные нарушения в ооцитах с результатами мейотического созревания, что служит поддержкой моделям бесплодия, связанного с анеуплоидией, применимо к заболеваниям.
- Практическая ценность: Позволяет проводить лонгитюдную оценку от остановки в профазе I до созревания в метафазе II, имитируя прогрессию мейоза in vivo.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод applicable в рамках рабочих процессов раннего поиска, в которых генетическое воздействие на ооциты сопровождается функциональным созреванием и количественным определением плоидности для обоснования выбора мишени.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о генах, регулирующих мейотические деления, за счет возможности микроинъекций и дозревания до стадии MII для фенотипической оценки.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные данные о плоидности путем подсчета кинетохоров, что позволяет проводить сравнение между различными экспериментальными условиями.
- Аналитика: позволяет получать измеримые результаты иммунофлуоресценции (количество точек центромер), которые коррелируют с эуплоидным или анеуплоидным статусом.
- Трансляционные исследования: связывает внутренние механизмы ооцитов со способностью к развитию, что актуально для доклинических моделей ответа на лечение бесплодия.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для оценки генетических мишеней в женских гаметах в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях сегрегации хромосом, обеспечивая прямой визуальный считываемый показатель плоидности в физиологически интактных яйцеклетках.
- Практическая ценность: Стандартизирует этапы сбора ооцитов, микроинъекции, созревания и фиксации для повышения воспроизводимости между экспериментами.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей работы с мишенями, выявляя дефекты мейоза на ранних стадиях, которые предсказывают неудачу развития.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков, основываясь на их влиянии на плоидность ооцитов и точность мейоза.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии, микроинъекций и иммунофлуоресцентного анализа при работе с хрупкими ооцитами.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая микроинъекторы, виброизоляционные столы и конфокальный микроскоп с 100x объективом.
- Необходима стандартизация гормональной стимуляции, среды сбора и концентрации монастрола для всех пользователей и центров.
- Адаптация метода для других видов млекопитающих может потребовать оптимизации времени созревания и чувствительности веретена деления к препарату.
- Метод ограничен ооцитами, возобновляющими мейоз in vitro; для некоторых последующих анализов может потребоваться партеногенетическая активация или оплодотворение.
